HPLC特征圖譜法比較去節麻黃與麻黃節的差異

安俐瑤,姜英子*,徐雅娟,解生旭,劉悅

(1.延邊大學，吉林 延吉 133000；2.吉林省中醫藥科學院，吉林省中藥藥效物質基礎重點實驗室，吉林 長春 130021)

麻黃為麻黃科麻黃屬植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)或木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的干燥草質莖[1]。麻黃辛溫，味微苦，入肺、膀胱經，具有發汗解表、宣肺平喘、利水消腫之功效[2]。關于麻黃的修治，最早見于張機的《金匱玉函經》：“麻黃，折去節，令通理，寸剉之，寸剉不如碎剉，如豆大為佳[3]。北京西鶴年堂將麻黃炮制成“魚子樣”以分類“去節麻黃”與“麻黃節”[4]。雷公云：凡使，去(根)節并沫，若不盡，服之令人(心)悶[5]。《桂林古本傷寒雜病論》中共載方劑四百余，用麻黃的方劑共29首，其中備注“去節”的方劑共14首[6]。可見“麻黃去節”在古代是必不可少的炮制工序。

以《傷寒論》中的“麻黃湯”與“射干麻黃湯”為例，分析麻黃去節與否的作用。麻黃湯記載“麻黃(去節)”，主治太陽病，頭痛發熱，身疼腰痛，骨節疼痛，惡風，無汗而喘[7]。麻桂并用，增強麻黃的發汗作用，此中重用麻黃發汗解表之功，以治表為主；射干麻黃湯未做“去節”標注，則按照不去節入藥。其具有化痰利咽，清肺降氣之功，此中重用麻黃宣肺平喘之功，以治里為主[8]。故可大概推測，古人用麻黃，發汗解表多去節，宣肺平喘不去節。

有學者用氣相色譜法對麻黃全草、節、去節各部位的主成分進行含量測定，結果表明，總麻黃堿的含量為，去節>全草>節[9]。近年來也有學者使用UPLC-Q TOF MSET探究麻黃蜜炙、酒制、醋制和炒炭的化學成分變化[10]。還有學者用指紋圖譜及PCA和CA法分析不同地區及正品、偽品麻黃藥材的質量差異，但是尚未系統研究麻黃去節與否的區別[11-12]。筆者建立15批去節麻黃和麻黃節的高效液相色譜(HPLC)特征圖譜，并采用聚類分析法(CA)和主成分分析法(PCA)對兩種炮制品進行分析。在特征圖譜的結果中去節麻黃被標記出6個共有峰，麻黃節樣品被標記出10個共有峰。CA結果中將兩種炮制品分為2類，PCA結果顯示，去節麻黃篩選出累計貢獻率達到85.634%的3個因子，麻黃節篩選出累計貢獻率達到83.976%的4個主成分。這說明了“去節麻黃”與“麻黃節”之間的差異，證明麻黃“去節”有炮制的必要，為后續開發復方中帶有“去節麻黃”的傳統制劑提供參考。

1 材料

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；水為娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。鹽酸麻黃堿對照品(批號：171241-201007，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸偽麻黃堿對照品(批號：171237-201208，中國食品藥品檢定研究院)。

麻黃藥材共收集15批樣品，根據《中國藥典》2015年版(一部)麻黃的含量測定方法，測定藥材中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿(以下簡稱總堿量)的含量，結果顯示：15批麻黃藥材總堿量均大于0.8%，全部符合藥典標準；所有去節麻黃的總堿量均大于麻黃節的總堿量。其中12批“去節麻黃”的總堿量接近“麻黃節”的總堿量的2倍，結果見表1。

表1 麻黃兩種供試品的總堿量

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 藥材的前處理 將麻黃藥材的節和節間分開，節的前后可留一小部分，所留部分應盡量小。兩種炮制品粉碎后過5號藥典篩。

2.1.2 指紋圖譜供試品溶液的制備 取“2.1.1”項下所得的樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率50 Hz)20 min，放冷，再稱定重量，用1.44%磷酸溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸麻黃堿對照品4.9 mg，鹽酸偽麻黃堿對照品4.4 mg以甲醇溶解，混合定容于100 mL容量瓶中。

2.3 HPLC指紋圖譜測定及共有峰鑒定

2.3.1 HPLC指紋圖譜色譜條件 Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL；流動相A：0.05%磷酸—0.05%三乙胺溶液，B：乙腈；梯度洗脫(0～4 min，2%→2% B；4～12 min，2%→4%B；12～28 min，4%→6%B；28～45 min，6%→9%B；45～60 min，9%→12%B；60～85 min，12%→18%B；85～87 min，18%→2%B)；波長210 nm。

2.3.2 HPLC指紋圖譜采集與分析 分別按照“2.3.1”項下條件分析混合對照品溶液和15批“麻黃節”供試品與“去節麻黃”供試品溶液，記錄87 min圖譜，混合對照品溶液HPLC色譜圖見圖1,15批去節麻黃HPLC色譜圖見圖2，15批麻黃節HPLC色譜圖見圖4。

15批麻黃節和去節麻黃的特征圖譜顯示，由對照品指認的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的特征峰均比較穩定，其中鹽酸偽麻黃堿峰面積適中，分離度較好，因而被選為參照峰(S)。將二者的特征圖譜分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版本)”軟件，以S1為參照圖譜，時間窗寬度設置為0.5 s，進行多點校正，全譜峰匹配后以中位數法生成2個共有模式圖譜，其中15批去節麻黃的共有模式圖譜見圖3，共6個共有峰；15批麻黃節的共有模式圖譜見圖5，共10個共有峰。計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2。

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

3.鹽酸麻黃堿；4.鹽酸偽麻黃堿

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

4.鹽酸麻黃堿；5.鹽酸偽麻黃堿

2.3.3 指紋圖譜的方法學考察

2.3.3.1 精密度試驗 精密稱取編號6的去節麻黃樣品和麻黃節樣品0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下條件進行HPLC分析，連續測定6次，測定記錄色譜圖，以參照峰的保留時間和峰面積為參比，結果見表3，可知該方法精密度好。

表2 15批去節麻黃與麻黃節指紋圖譜共有峰的相對峰面積與相對保留時間RSD值

2.3.3.2 重復性試驗 精密稱取編號6的去節麻黃和麻黃節樣品，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行HPLC分析，結果見表3，由表可知該方法重復性良好。

2.3.3.3 穩定性試驗 按“2.1.3”項下方法制備麻黃節和去節麻黃供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項下條件進行HPLC分析，24 h內結果見表3，由表可知該方法制備的供試品溶液在24 h內穩定。

表3 方法學的RSD值

2.3.4 15批麻黃藥材相似度評價 以15批麻黃節和去節麻黃藥材共有模式圖譜為標準，進行整體相似度評價，15批去節麻黃藥材的相似度為0.879～0.994，15批麻黃節藥材的相似度在0.895～0.996，結果見表4。

2.3.5 聚類分析 使用SPSS 22.0軟件對30批樣品(其中1～15號為去節麻黃樣品，16～30號麻黃節)進行系統聚類分析，采用組間連接法，得到聚類樹狀圖，見圖6。

圖6顯示當類間距離介于15～20時，去節麻黃和麻黃節可以被明顯地聚為2類。

2.3.6 主成分分析 采用SPSS 22.0軟件，以絕對共有峰面積為變量，分別計算主成分特征值、貢獻率及累積貢獻率。選取特征值>1,主成分累計貢獻率>70%以上者，由表5～6、圖7～8可看出，去節麻黃中前3個主成分能代表去節麻黃特征圖譜，而麻黃節中前4個主成分能代表麻黃節特征圖譜。

表4 15批去節麻黃與15批麻黃節的指紋圖譜相似度

圖6 15批去節麻黃和15批麻黃節的聚類樹狀圖

表5 去節麻黃特征值表

表6 麻黃節特征值表

圖7 去節麻黃特征值散點圖

圖8 麻黃節特征值散點圖

豎讀表7和表8發現去節麻黃和麻黃節因子載荷矩陣中因子1在多數共有峰的上有較大的載荷。因此，兩種炮制品中的因子1可初步確定為綜合因子，即認為主成分1可以反映兩種炮制品特征圖譜較全面的信息。由表9可知因子1中3號共有峰得分系數的絕對值最高，因此，去節麻黃的主成分分析中，與因子1最密切的共有峰為3號共有峰。由表10可以知主成分1中2號共有峰得分系數的絕對值最高，與之相近的是9號共有峰。因此，與主成分1最密切的共有峰為2號共有峰，9號共有峰也值得關注。

表7 去節麻黃主成分因子載荷矩陣

表9 去節麻黃主成分得分系數矩陣及保留時間

表10 麻黃節主成分得分系數矩陣及保留時間

3 討論

3.1 色譜柱考察 考察了Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和 Phenomenex Polar-RP 80A(4.6 mm×250 mm,4 μm)色譜柱。結果顯示，使用Phenomenex Polar-RP 80A色譜柱時麻黃堿和偽麻黃堿2個對照峰分離效果優于Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，但是其余成分分離效果不好，無法體現指紋圖譜的特征性，因此采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱。

3.2 流動相和檢測波長的考察 分別考察了210 nm下使用磷酸和甲酸、260 nm下使用磷酸和甲酸的條件。發現使用甲酸時檢測波長在210 nm時紫外吸收較大，基線不平穩，干擾特征圖譜生成，但波長在260 nm時無論使用甲酸或者磷酸麻黃堿和偽麻黃堿兩個對照峰不明顯，因此最終使用磷酸-210 nm作為流動相。后續考察了磷酸濃度為0.05%和0.1%時的峰譜，當酸水濃度從0.1%濃度的磷酸溶液降到0.05%時，36 min處原本上浮的基線下降，這使得峰面積更加準確，成分分離效果更好。

3.3 供試品提取方法考察 考察了磷酸超聲提取和水煎煮提取，結果顯示，二者所能提取的主要物質基本相同，但是磷酸超聲能提取出較多的生物堿類成分，在水煎液的指紋圖譜中雜質較多，影響主成分的有效分離。因此最終選擇磷酸超聲提取。

3.4 相似度分析 依據本研究的測定方法，15批麻黃藥材的特征圖譜基本吻合，其中14批藥材的相似度大于0.9，僅有1批來自吉林瞻榆朝陽村的藥材無論是節與去節的供試品相似度均小于0.9，表明該地區藥材質量可能存在質量不穩定情況。

3.5 聚類分析和主成分分析 PCA過程會自動生成各因子的權重，可較大程度上抵制人為評價的干擾；CA能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，兩者結合分析使分析的結果更加客觀。CA結果顯示，15批麻黃樣品并未完全按照產地分別聚類，不同產地的藥材仍有共性，這說明麻黃藥材并未因地域分布而存在較大差異，這可以保證大生產時投料的穩定性。PCA結果顯示，去節麻黃中前3個主成分能代表去節麻黃特征圖譜，而麻黃節中前4個主成分能代表麻黃節特征圖譜，這說明麻黃節中所含物質較去節麻黃多。在去節麻黃中與主成分1最密切的共有峰是3號峰即鹽酸麻黃堿峰，而麻黃節中顯示與主成分1有密切關系的峰為2號峰和9號峰，并非由對照品指認的峰。由此可推斷，去節麻黃樣品主要發揮作用的化學成分應為麻黃堿類物質，麻黃堿類物質可以興奮β受體引起發汗，這與前述的功效推斷相吻合[13-14]。

4 小結

本文首次建立特征圖譜并采用聚類分析與主成分分析法對去節麻黃與麻黃節做了系統對比，特征圖譜按照“節與去節”將兩種炮制品聚成兩個亞類，這說明二者在成分上有明顯差別，同時也說明麻黃在使用時需做去節炮制的必要性。聚類分析時關于藥材產地的聚類不明顯，由此推測是每個產地的藥材批次數量不足的緣故。建議以后的學者可使用更多批次的藥材進行特征圖譜的考察，并建立更便捷高效的方法。主成分分析時，發現在去節麻黃樣品中3號共有峰(鹽酸麻黃堿峰)是影響其特征圖譜的主要色譜峰，而麻黃節樣品中影響其特征圖譜的主要色譜峰是2號共有峰和9號共有峰，因此證明了以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量作為評價麻黃質量的指標是片面的。