定向演化技術與蛋白質工程
——解讀2018年諾貝爾化學獎

楊 冬 徐經緯

（北京師范大學生命科學學院 北京 100875）

2018年美國化學家Frances Arnold 獲得了諾貝爾化學獎。其主要成就是在蛋白質的定向演化（directed evolution）上作出了開拓性的貢獻。利用定向演化技術，科學家可提高酶的活性，改變酶的底物或產物范圍，提高酶在特殊環境下的穩定性等，從而使酶在工業上有更廣泛的應用潛力。不僅如此，定向演化實驗還可以為研究蛋白質在自然環境下的演化歷程提供數據，從而在進化論的理論研究上作出貢獻。什么叫定向演化？ 它又有什么用途？

蛋白質在生命活動的各個方面都發揮著重要作用,同時，其作為生物催化劑或新型大分子藥物也具有重要的應用價值。因此，通過改造蛋白質分子以改進其生物活性在工業上具有重要意義。這一技術稱為蛋白質工程。由于蛋白質的性質是由其氨基酸序列所決定的，因此，通過改變蛋白質的氨基酸序列，就可能改變其特性，從而設計出具有新型特征的蛋白質。然而，要成功改造一個蛋白質，需知道應在其氨基酸序列的哪些位點作出哪些改變。目前主要有2種策略。一種策略被稱為理性設計（rational design），即利用已知的該蛋白質結構和功能的信息，進行定點突變，從而改變該蛋白質的特性，實現對其的改造。但是，在這一領域中,最大的困難是目前還不能精確地建立蛋白質結構和功能之間的關系［1］。因此，對于大部分體系而言，理性設計的效率并不高。另一個策略則是進行定向演化［1-2］。在這一思路下，研究者不需要針對蛋白質的工作機理作出假設，而是利用進化的原理，經過多輪篩選，從突變文庫中選擇出具有所需特性的蛋白質。

定向演化的整個過程可以總結如下（圖1）。首先需要建立一個突變文庫，然后表達出蛋白質，并針對蛋白質的特定功能對其進行篩選，從而獲得符合要求的突變體進入下一輪。通常，這些突變體帶有能表達出具有所需特性蛋白質的突變基因。之后，在所獲得的突變體基礎上進行進一步突變，構建新的突變文庫，再進行下一輪篩選。這樣，經過多輪選擇或篩選的過程，就有可能得到設計者所期望的最終產物。本文將以Arnold 的工作為例，介紹這幾年定向演化研究的具體成果。

圖1 定向演化的典型流程

1 改造枯草桿菌蛋白酶使之適應二甲基甲酰胺（DMF）環境

酶在有機溶劑環境下，有時可以催化其在水相環境中無法催化的反應。例如，絲氨酸蛋白酶在極性有機溶液環境下可以催化合成某些高分子化合物［3］。因此，通過改造酶的序列，增強其在某些有機溶劑中的催化能力，很可能具有工業上的應用價值。例如，可用于合成某些有經濟價值的手性化合物。

Arnold 的研究組之前已獲得了含有3位氨基酸替換的枯草桿菌蛋白酶突變體（3M）和含有4位氨基酸替換的突變體（4M），其在含有20%～40%的DMF 環境下較野生型具有更高的催化效率（即更高的kcat/Km值）（圖2）［3］。在定向演化實驗中，研究人員利用易錯PCR 技術在4M 基礎上引入了隨機突變，構建突變文庫并轉化B.subtilis細胞，在含有酪蛋白和DMF 的固體培養基上進行培養。由于枯草桿菌蛋白酶是分泌蛋白，并可催化酪蛋白的水解反應，因此，其活性可通過觀察培養基上的暈圈進行判斷。通過挑選具有最大暈圈的克隆，即可獲得本輪演化過程中的最佳突變體。然后對其再進行突變，構建突變文庫，轉化細胞進行下一輪篩選。經過幾輪這樣的篩選，最后就得到了能在高濃度DMF 環境下有效發揮催化作用的枯草桿菌蛋白酶突變體（PC3）［3］。

在40%的DMF 濃度下，PC3的催化效率是野生型的100倍以上，與4M 相比，也比其高2倍以上（圖2）。不僅如此，PC3還可在更高的DMF 濃度下發揮催化作用。在60%和85%的DMF 條件下，其催化效率分別達到野生型的256倍和131倍。由于當初進行這一定向演化實驗的主要目的是為了利用絲氨酸蛋白酶在極性有機溶劑條件下合成高分子化合物的能力，研究人員還特別對此進行了檢測。結果發現，PC3在70%的DMF 條件下可催化合成約15mg 的多聚-L-甲硫氨酸，其聚合度達到4.7kD。而野生型蛋白質只能在60%的DMF 條件下合成聚合度約1.0～1.5kD 的多聚-L-甲硫氨酸［3］。

圖2 枯草桿菌蛋白酶野生型蛋白質和各個突變體水解底物sAAPF-pna 的動力學參數（數據來自Chen，K［3］）

2 逆轉海因酶（hydantoinase）的對映體選擇性（enantioselectivity）

海因酶的作用是水解5′-單取代海因（5-monostubstituted hydantoin），將其轉變為N-氨甲酰基氨基酸（N-carbamoyl amino acid），而后者則可在L-氨甲酰水解酶（L-carbamoylase）的作用下轉變成氨基酸。所以海因酶在工業界可被用于氨基酸的合成。但是，5′-單取代海因有L-和D-2種對映體（圖3）［4］。在甲硫氨酸的合成過程中，海因酶偏好的底物是D-對映體，即D-5-（2-甲硫基乙基）-海因（D-MTEH），因此無法用于L-甲硫氨酸的合成。所以如果能將海因酶的底物選擇性轉變為L-對映體，即L-5-（2-甲硫基乙基）-海因（LMTEH），則將有重要的工業意義。

圖3 5-單取代海因的L-、D-對映異構體［4］

在這項工作中，研究者通過易錯PCR 技術在海因酶的序列中引入隨機突變，構建了突變文庫。之后將細胞培養在含有D-MTEH 或L-MTEH 的培養基上，并通過檢測pH 的變化跟蹤海因酶催化的反應，從而實現對突變體的篩選。通過篩選了約10000個克隆，研究者發現了突變體19AG11和11DH7。使用手性HPLC 技術對這2個突變酶進行研究表明，雖然它們還是偏向使用D-MTEH作為底物，但其對D-對映體的選擇性顯著變弱。由于這2個突變體都包含有I95L 突變，研究者進一步構建了含有I95L/Q251R 突變的突變體11DH7，并在此基礎上引入了新的隨機突變進行第2輪篩選，得到了22CG2。該突變體的對映體選擇性與11DH7相同，但是其活性有所提高［4］。

由于繼續使用易錯PCR 技術似乎很難進一步提高酶對L-MTEH 的選擇性，研究者打算另辟途徑。他們在前期研究中發現I95可能在對映體的選擇性上有重要作用，于是就在22CG2的基礎上，對第95位氨基酸進行了飽和突變。結果發現，一個突變體Q2H4（含有I95F）具有明顯的L-MTEH選擇性，且其活性在22CG2的基礎上還有進一步提高［4］。在E.coli中構建含有Q2H4的代謝通路后，經過發酵可明顯觀察到L-甲硫氨酸的積累［4］。這一結果顯示了該突變體在氨基酸合成工業上的潛力。這項工作同時證明了先使用易錯PCR 取樣序列空間進行粗篩，找到關鍵氨基酸后，再利用飽和突變進行更加精細的篩選，從而實現酶的定向演化這一思路的可行性。

3 通過定向演化改造類胡蘿卜素合成路線中的酶從而獲得新型產物

萜類化合物是一大類具有極大多樣性的天然產物，其構成單元為異戊二烯。在生物合成過程中，細胞利用不同的反應途徑先合成異戊二烯焦磷酸（isoprenyl pyrophosphate，IPP）及其異構體二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）。然后通過聚合反應，細胞可以合成包含有不同異戊二烯單元的線性分子，之后由不同的萜烯合成酶催化環化反應，再經過進一步的修飾（如羥化等）從而生成各類最終的萜類產物。類胡蘿卜素屬于四萜類化合物，即它們均含有8個異戊二烯單元。所有的類胡蘿卜素的前體都是含有8個異戊二烯單元的八氫番茄紅素（phytonene）。在該化合物的基礎上，八氫番茄紅素去飽和酶（phytonene desaturase）可以引入2-6個碳-碳雙鍵（取決于該酶的物種來源），從而形成具有不同飽和程度的類胡蘿卜素產物（圖4）［5］。在通常情況下，八氫番茄紅素去飽和酶引入的雙鍵數量不超過5個。只有來源于E.uredovora的酶可以催化合成少量的完全共軛的3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素 （3，4，3′，4′-tetradehydrolycopene），即被引入6個雙鍵的產物［5］。

圖4 八氫番茄紅素去飽和酶催化從八氫番茄紅素脫氫產生不同的類胡蘿卜素產物

類胡蘿卜素具有抗氧化活性，因此，其在抗腫瘤或慢性疾病的治療方面具有潛在的應用價值。在這項研究中，Arnold 的團隊試圖探索通過改造類胡蘿卜素合成通路上的酶，從而合成新型的類胡蘿素的可能性［5］。在研究過程中，研究人員使用了DNA改組（DNA shuffling）技術，將來源于E.uredovora和E.herbicola的八氫番茄紅素去飽和酶進行同源重組，從而獲得了可供篩選的突變文庫。之后，在E.coli中表達合成上游產物香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate） 和八氫番茄紅素的合成酶,以及這些八氫番茄紅素的去飽和酶突變體。由于類胡蘿卜素是有顏色的，因此可直接通過觀察克隆的顏色進行篩選。通過篩選約10000個克隆，研究人員得到了突變體Ⅰ14［5］。Ⅰ14的顏色為粉色，說明其產物含有比番茄紅素（lycopene）更多的雙鍵。通過HPLC 最后鑒定該酶確實可催化3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素的合成。

在此基礎上，研究者又同樣使用DNA 改組技術，建立了番茄紅素環化酶的突變文庫。在表達香葉基香葉基焦磷酸和八氫番茄紅素的合成酶，以及八氫番茄紅素去飽和酶突變體Ⅰ14的E.coli細胞中，經過篩選4500個克隆，最后發現了一個鮮紅色的克隆（Y2），其產物經過HPLC 分析被鑒定為包含有紅酵母烯（torulene）［5］。該物質是3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素的前體3，4-脫氫番茄紅素（3，4-didehydrolycopene）的環化產物。此項研究在歷史上第1次鑒定出能通過直接環化3，4-脫氫番茄紅素從而合成紅酵母烯的酶［5］。

4 總結與展望

目前，通過定向演化技術對蛋白質分子進行改造可提高或改變其活性。這項技術具有很強的應用潛力，可以開發新型的酶用于化學合成工業，從而合成單純使用化學合成方法難以經濟性地實現其合成的產物。

此外，定向演化技術所獲得的數據對于研究蛋白質的分子演化也有一定的價值。例如，Arnold組在研究細胞色素P450蛋白時，通過定向演化將原先催化長鏈脂肪酸羥化的P450BM3，改造成專一利用丙烷作為底物的P450PMOR2［6］。在這一定向演化實驗中，研究人員進行了多輪篩選。在分析每一輪篩選所選中的突變體（即演化中間體）的催化性質后，發現隨著演化的進行，其中間體對于丙烷的kcat逐漸增大，Km逐漸減小［7］。但是，蛋白質的熱穩定性也隨著演化的進程而逐步下降［7］。到突變體35E11時，蛋白質的穩定性達到最低值［7］。而之后的突變體ETS8的熱穩定性則明顯恢復，再之后的突變體19A12包含了一個重要的L188P 突變［7］。該突變本身對P450的穩定性有很大的削弱，但是此突變對于酶的專一性轉向氣相烷烴（比如丙烷）起著決定性的作用［7］。從19A12開始，該P450蛋白的最佳底物轉變成了短鏈烷烴，其長度約3～4個碳原子，而之前的演化中間體則都有比較寬廣的底物范圍（包含3～9個碳原子的烷烴）［7］。

這一演化歷程中，那些改變酶的底物特異性或提高其催化效率的突變在此演化體系中被認為是“有利”突變，是被選擇的對象。然而，這些突變往往對蛋白質的穩定性具有破壞作用。因此，當蛋白質演化到某個階段（即35E11）時，其穩定性已非常低，乃至不可能再積累這些“有利”突變。而同時另一些突變對酶的催化則沒有直接影響，但是可提高酶的穩定性。在野生型酶或比較早期的演化中間體中，這些突變屬于中性突變，因為此時酶的穩定性很高，再提高其穩定性并不會使之具有選擇優勢［2］。然而，當演化到ETS8的時候，因為具有增加蛋白質穩定性突變基因的突變體可容納更多的“有利”突變，這將導致這些新一代的突變體能被選擇出來。所以提高蛋白質穩定性的突變可提高蛋白質的可演化性（evolvability）［2］。在自然進化過程中，這些提高蛋白質穩定性的突變很可能是通過中性突變-隨機漂變的方式在蛋白質中逐漸積累。因此，定向演化實驗可能闡明在自然演化過程中中性突變對于蛋白質演化的影響作用。