基于生物信息學挖掘糖尿病心肌病表達譜芯片

石 磊 李萬鵬 安軍鈺 劉怡 吳鵬 吳文宇 曹云山 黃晏

[摘要] 目的 基于生物信息學技術挖掘糖尿病心肌病（DC）相關差異表達基因及其功能。 方法 應用生物信息學方法分析基因表達譜數據集GSE4547。 結果 挖掘原始芯片數據，篩選到79個差異表達基因。基于基因本體論功能注釋和相關通路分析，以及通過構建差異共表達基因蛋白質互作網絡及模塊分析后，最終獲得Hk2、Col1a2、Col1a1、Col3a1、Slc2a1、Cpt1a、Slc2a4、Cd36、Ucp3、Pdk4 10個關鍵基因為鏈脲佐菌素誘導DC的關鍵基因。 結論 最終獲得的10個關鍵基因可能成為未來治療糖尿病心肌病的潛在治療靶點，為今后探究與DC相關基因和信號通路的功能變化提供新的視角和導向。

[關鍵詞] 糖尿病心肌病;GEO數據庫;差異表達基因;基因芯片;生物信息學技術

[中圖分類號] R587.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（c）-0019-05

[Abstract] Objective To explore differentially expressed genes and their function related to diabetic cardiomyopathy （DC） based on bioinformatics technology. Methods The gene expression profile data set GSE4547 was analyzed using bioinformatics methods. Results The original chip data was mined and 79 differentially expressed genes were screened. Based on gene ontology functional annotation and related pathway analysis， as well as the construction of differentially coexpressed genes protein-protein interaction and module analysis， 10 key genes of Hk2， Col1a2， Col1a1， Col3a1， Slc2a1， Cpt1a， Slc2a4， Cd36， Ucp3 and Pdk4 were finally obtained as the key genes of Streptozozin induced DC. Conclusion The 10 key genes eventually obtained may become potential therapeutic targets for the treatment of DC in the future， and provide a new perspective and guidance for the exploration of functional changes of DC related genes and signaling pathways in the future.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy; GEO database; Differentially expressed genes; Gene chip; Bioinformatics technology

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是一種特殊的心臟疾病，其發(fā)生與心臟組織對胰島素代謝作用的抵抗、代償性高胰島素血癥和高血糖等有關，與冠狀動脈疾病和高血壓等其他心臟危險因素無關[1]。盡管研究已證實，多種因素可能共同促進DC的進展，但是推動這些病理過程的確切分子機制尚不完全清楚[2]。研究表明[3]，DC可能是一種由多種基因和多個信號通路參與的疾病。本研究擬利用生物信息學技術從GEO數據庫中挖掘與DC相關的差異表達基因，從而探究與DC相關的基因和信號通路的功能變化，為DC的發(fā)病機制及可能存在的治療靶點提供新的視角和導向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據的獲取

從GEO數據庫下載GSE4547基因表達譜數據集，該芯片分析基于GPL85平臺。GSE4547數據集包括3、28、42 d標本，本研究選取42 d糖尿病心肌病小鼠模型4只和對照組小鼠4只。標本類型為小鼠心肌組織。

1.2 相關差異表達基因數據的處理

下載DC組織基因芯片GSE4547的探針文件和CELL數據壓縮包后，通過R軟件對原始數據進行標準化處理后，采用Limma包進行差異表達值計算，以變化倍數>2（|log FC|>1）且P < 0.05選取差異表達基因[4]。通過R軟件的gplots包繪制熱圖（heatmap）。

1.3 差異表達基因數據的功能和富集分析

應用DAVID軟件進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）進行通路分析，以P < 0.05為選取標準。

1.4 構建差異共表達基因蛋白質互作網絡及模塊

利用String軟件對差異表達基因間的差異共表達基因蛋白質互作網絡（protein-protein interaction，PPI）進行評價。將從String中獲得的聯合評分>0.4的中等置信度的相互作用的節(jié)點數據導入Cytoscape軟件進行模塊分析。

1.5 確定關鍵基因

應用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件通過MCC、MNC和DMNC算法分別獲得了前15位基因，繪制韋恩圖后獲得關鍵基因。

2 結果

2.1 糖尿病心肌組織的差異表達基因

通過R語言中的Affy包、Limaa包對原始芯片數據進行標準化后進行差異表達分析，最終獲得79個差異表達基因（包括40個上調基因、39個下調基因）。見圖1。

2.2 差異表達基因功能和通路途徑分析

使用DAVID在線分析軟件進行GO分析和KEGG通路分析后，這些差異表達基因在生物學過程中（biological process）主要參與了藥物反應等，見圖2A;在細胞組件（cellular component）中主要集中在線粒體，見圖2B;在分子功能層面（molecular function）主要參與了C3HC4型RING指結構域結合等功能，見圖2C;差異表達基因中9個最顯著差異的KEGG通路，它們主要集中在金黃色葡萄球菌感染等信號通路，見圖2D。

2.3 差異共表達基因蛋白質互作網絡及模塊分析

將得到的差異基因導入到String在線分析軟件中，得到差異共表達基因PPI，該網絡由56個節(jié)點、98條邊組成，見圖3A，將數據導入Cytoscape軟件中MCODE插件進行模塊分析，截斷標準是degree cut-off≥2，a k-core≥3。進而確定3個可視化模塊，見圖3B～D，其中圖3B由5個節(jié)點和10條邊組成，圖3C由4個節(jié)點和6條邊組成，圖3D由4個節(jié)點和5條邊組成。

2.4 關鍵基因的確定

關鍵基因是根據cytoHubba中3種排序方法將基因重疊確定的，見圖4。最終獲得Hk2、Col1a2、Col1a1、Col3a1、Slc2a1、Cpt1a、Slc2a4、Cd36、Ucp3、Pdk4 10個關鍵基因為鏈脲佐菌素（STZ）誘導DC的關鍵基因。見表1、圖5。

3 討論

基于基因表達數據庫挖掘疾病的差異表達基因，現已成為當今生物醫(yī)學領域研究的熱點之一[5]。DC是糖尿病患者后期一種嚴重威脅生命的并發(fā)癥，其進展為心力衰竭的主要病理生理學特征是胰島素抵抗、心臟胰島素信號傳遞受損、高血糖等。然而，糖尿病與心血管疾病關系的復雜性是減少DC發(fā)生和進展的重要挑戰(zhàn)之一[6]。本研究應用生物信息學技術，挖掘GEO數據庫中涉及DC的基因芯片數據，探究DC相關基因和信號通路的功能變化。在本研究中，應用生物信息學技術分析后最終獲得了10個關鍵差異表達基因：Hk2、Col1a2、Col1a1、Col3a1、Slc2a1、Cpt1a、Slc2a4、Cd36、Ucp3、Pdk4。

HK2是一種己糖激酶的同工酶，其通過催化葡萄糖磷酸化發(fā)揮對葡萄糖-6-磷酸的抑制作用[7]。有研究指出，HK2活性降低會引起細胞內葡萄糖磷酸化障礙，從而導致糖耐量受損[8]。COL1A1、COL1A2、COL3A1是屬于膠原蛋白家族的成員。COL1A1、COL1A2和COL3A1是Ⅰ型膠原的主要組成部分[9]。糖尿病心肌纖維化病理表現為膠原大量沉積，導致心室壁的僵硬度增高和順應性降低，主要原因為Ⅰ型膠原蛋白的過量表達[10]。Gaikwad等[11]發(fā)現，糖尿病組小鼠心肌中Col3a1表達下降，可能與組蛋白H3在胰島素抵抗條件下參與心臟和腎臟的共價修飾有關，具體機制仍有待進一步闡明。

SLC2A1、SLC2A4分別編碼葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）。葡萄糖通過葡萄糖轉運體進入心肌細胞，其中GLUT1和GLUT4在數量上最為重要[12]。Kainulainen等[13]在糖尿病小鼠模型中發(fā)現，隨著GLUT1和GLUT4表達下降，出現胰島素抵抗，干擾心肌細胞胰島素信號通路，導致心肌細胞代謝紊亂，進而發(fā)展為心肌纖維化和舒張功能不全。CPT1A是線粒體中脂肪酸氧化的一種關鍵酶，Jeffrey等[14]在實驗中發(fā)現，直接抑制Cpt1a的攝取是將心肌能量代謝從游離脂肪酸轉化為葡萄糖利用的有效途徑。鏈霉素誘導的糖尿病大鼠經Cpt1抑制劑處理后，心肌葡萄糖氧化速率增加，心臟功能恢復[15]。CD36是一種脂肪酸轉位酶。在糖尿病表型小鼠模型中，敲除Cd36后心肌組織脂質積累減少、葡萄糖氧化增加進而使心臟功能恢復[16]。

UCP3是線粒體負離子載體蛋白家族中的一員，主要參與線粒體能量代謝和氧化應激。Umbarkar等[17]在誘導大鼠糖尿病模型中觀察到糖尿病組心肌組織中UCP3蛋白表達量顯著增加。Boudina等[18]在實驗中發(fā)現與野生型小鼠相比，從2型糖尿病小鼠分離、灌注的心臟能量代謝效率降低，ATP生成減少。PDK4是細胞中參與葡萄糖代謝氧化的關鍵調節(jié)酶之一。Thapa等[19]的研究數據表明，adropin在心肌細胞中通過降低Pdk4的表達來降低對丙酮酸脫氫酶（PDH）活性的抑制，從而促進心肌葡萄糖的利用。

綜上，本研究應用生物信息學技術挖掘GEO數據庫，最終獲得Hk2、Col1a2、Col1a1、Col3a1、Slc2a1、Cpt1a、Slc2a4、Cd36、Ucp3、Pdk4 10個關鍵基因。初步揭示了這些關鍵基因可能成為未來治療糖尿病心肌病的潛在治療靶點，為今后探究與DC相關基因和信號通路的功能變化提供新的視角和導向。

[參考文獻]

[1]? Jia G，Whaley-Connell A，Sowers JR. Diabetic cardiomyopathy：a hyperglycaemia- and insulin-resistance-induced heart disease [J]. Diabetologia，2018，61（1）：21-28.

[2]? Varga ZV，Giricz Z，Liaudet L，et al. Interplay of oxidative，nitrosative/nitrative stress，inflammation，cell death and autophagy in diabetic cardiomyopathy [J]. Biochim Biophys Acta，2015，1852（2）：232-242.

[3]? Varma U，Koutsifeli P，Benson VL，et al. Molecular mechanisms of cardiac pathology in diabetes - Experimental insights [J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2018， 1864（5 Pt B）：1949-1959.

[4]? Ritchie ME，Phipson B，Wu D，et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies [J]. Nucleic Acids Res，2015，43（7）：e47.

[5]? Min S，Lee B，Yoon S. Deep learning in bioinformatics [J]. Brief Bioinform，2017，18（5）：851-869.

[6]? Jia G，DeMarco VG，Sowers JR. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in diabetic cardiomyopathy [J]. Nat Rev Endocrinol，2016，12（3）：144-153.

[7]? Nederlof R，Eerbeek O，Hollmann MW，et al. Targeting hexokinase Ⅱ to mitochondria to modulate energy metab-olism and reduce ischaemia-reperfusion injury in heart [J]. Br J Pharmacol，2014，171（8）：2067-2079.

[8]? Mueckler M，Thorens B. The SLC2（GLUT）family of membrane transporters [J]. Mol Aspects Med，2013，34（2/3）：121-138.

[9]? Eghbali M，Weber KT. Collagen and the myocardium： fibrillar structure， biosynthesis and degradation in relation to hypertrophy and its regression [J]. Mol Cell Biochem，1990，96（1）：1-14.

[10]? Tang M，Zhang W，Lin H，et al. High glucose promotes the production of collagen types Ⅰ and Ⅲ by cardiac fibroblasts through a pathway dependent on extracellular-signal-regulated kinase 1/2 [J]. Mol Cell Biochem，2007， 301（1/2）：109-114.

[11]? Gaikwad AB，Gupta J，Tikoo K. Epigenetic changes and alteration of Fbn1 and Col3A1 gene expression under hyperglycaemic and hyperinsulinaemic conditions [J]. Biochem J，2010，432（2）：333-341.

[12]? Barrett EJ，Schwartz RG，Francis CK，et al. Regulation by insulin of myocardial glucose and fatty acid metabolism in the conscious dog [J]. J Clin Invest，1984，74（3）：1073-1079.

[13]? Kainulainen H，Breiner M，Schürmann A，et al. In vivo glucose uptake and glucose transporter proteins GLUT1 and GLUT4 in heart and various types of skeletal muscle from streptozotocin-diabetic rats [J]. Biochim Biophys Acta，1994，1225（3）：275-282.

[14]? Jeffrey FM，Alvarez L，Diczku V，et al. Direct evidence that perhexiline modifies myocardial substrate utilization from fatty acids to lactate [J]. J Cardiovasc Pharmacol，1995，25（3）：469-472.

[15]? Wall SR，Lopaschuk GD. Glucose oxidation rates in fatty acid-perfused isolated working hearts from diabetic rats [J]. Biochim Biophys Acta，1989，1006（1）：97-103.

[16]? Yang J，Sambandam N，Han X，et al. CD36 deficiency rescues lipotoxic cardiomyopathy [J]. Circ Res，2007，100（8）：1208-1217.

[17]? Umbarkar P，Singh S，Arkat S，et al. Monoamine oxidase-A is an important source of oxidative stress and promotes cardiac dysfunction，apoptosis，and fibrosis in diabetic cardiomyopathy [J]. Free Radic Biol Med，2015，87：263-273.

[18]? Boudina S，Sena S，Theobald H，et al. Mitochondrial energetics in the heart in obesity-related diabetes：direct evidence for increased uncoupled respiration and activation of uncoupling proteins [J]. Diabetes，2007，56（10）：2457-2466.

[19]? Thapa D，Stoner MW，Zhang M，et al. Adropin regulates pyruvate dehydrogenase in cardiac cells via a novel GPCR-MAPK-PDK4 signaling pathway [J]. Redox Biol，2018，18：25-32.

（收稿日期：2019-03-18? 本文編輯：張瑜杰）