母乳與山羊乳功能性不飽和脂肪酸及脂肪球微觀結構的比較

張 宇，王立娜，張宏達，李曉東,*，劉 璐，冷友斌，鞏燕妮，蔣士龍

（1.東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江飛鶴乳業有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江完達山林海液奶有限公司，黑龍江 牡丹江 157100）

母乳為嬰兒提供所需的膳食能量、必需營養素以及生理活性分子。母乳的脂質占母乳總能量的40%～55%，為新生兒提供了大約一半的能量需求；同時，其也提供了基本的脂肪酸（fatty acid，FA）和脂溶性維生素。功能性FA是特指那些來源于人類膳食油脂、滿足人體營養需求，并對人體一些相應缺乏癥和內源性疾病有積極防治作用的FA，如花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、亞油酸（linoleic acid，LA）等。功能性FA的組成與含量取決于乳的品種、泌乳階段等[1]。郭紫玥[2]綜合研究了母乳與牛乳、羊乳中3 種主要功能性FA（ARA、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA））的變化規律，發現與牛乳相比，羊乳中這3 種FA水平與母乳更為接近。山羊乳含有人體所需要的多種營養素及生物活性物質[3]，且脂肪結構與母乳較為接近，營養價值高。解慶剛等[4]研究發現山羊乳有牛乳和綿羊乳不可比擬的優勢，其脂肪更容易被消化；山羊乳中不易消化的棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）含量比牛乳低，而易消化的中短鏈FA比牛乳和綿羊乳高。

乳中脂肪以微小的球狀液滴或乳脂肪球（milk fat globule，MFG）的形式分布，以乳液形式穩定存在。Keenan[5]、Mather[6]以及Heid[7]等對優質母乳MFG的來源和分泌進行了詳細的介紹，認為MFG在乳腺的分泌細胞中形成。甘油三酯（triacylglycerols，TAG）在粗面內質網表面上或表面內合成，并在細胞質中以微脂滴的形式積累；MFG的粒徑、分布與多種因素有關，即使同一種乳的MFG，其粒徑也會有很大差異，與乳的性質和加工特性密切相關[8]。

目前，對不同泌乳期母乳MFG粒徑和ζ電位的研究較少，對不同泌乳期母乳與山羊乳主要功能性FA及MFG物理結構的差異也鮮有系統性地研究，尤其是對功能性FA中DHA的最佳補充水平還鮮有研究；同時，對MFG物理結構與FA含量之間的相關性分析也較少。因此，本研究測定不同泌乳期母乳與山羊常乳中主要功能性不飽和FA的相對含量，并比較不同泌乳期母乳與山羊乳MFG物理特性的差異，與FA相對含量進行相關性分析，深入了解母乳不同泌乳期及山羊乳脂肪結構和主要功能性FA的組成差異，為FA母乳化的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳采集：母乳樣本在吉林省松原市根據文獻[2]中具體采樣方案進行采集，采集后的樣品于-20 ℃冷凍保存，待檢。山羊乳采集：研究對象為健康的純種奶山羊，在黑龍江哈爾濱地區由專業養殖人員根據文獻[2]中具體采樣方案進行采集，樣品置于-20 ℃的冷凍箱中，待檢。

甲醇、乙醚、石油醚、乙醇 北京索萊寶科技有限公司；焦性沒食子酸、正己烷、尼羅紅、氯化鈉、氫氧化鉀 天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

3K15臺式冷凍離心機 德國Sigma公司；PS-60AL超聲波清洗器 深圳市深華泰實業有限公司；68523氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；N100氮吹儀 上海精密儀器儀表有限公司；Mastersize 2000激光散射粒度分析儀、Nano-Z電位儀 英國馬爾文公司；激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品分組

初乳為1～7 d母乳（n＝15），過渡乳為7～14 d母乳（n＝15），成熟乳為超過14 d母乳（n＝20），山羊乳為常乳（n＝20），其中n表示樣品數。

1.3.2 乳中脂肪質量濃度和FA相對含量的測定

采用巴布科克法（AOAC 989.04）測定母乳與山羊乳脂肪的質量濃度。

參考Folch等[9]的方法提取乳中的脂肪。參考Kelly[10]、王存芳[11]等的堿催化法對乳脂肪進行前處理，用面積歸一化法定量。

色譜柱為HP-5MS（質量分數5%苯甲基硅烷）彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），氦氣流速為0.8 mL/min。起始柱溫為40 ℃，保持2 min；首先以8 ℃/min升到200 ℃；然后以3 ℃/min升到215 ℃；最后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min；280 ℃后運行2 min。進樣量為10 μL，分流比為30∶1。進樣口溫度260 ℃，檢測器溫度280 ℃。電子轟擊離子源；離子源溫度為230 ℃，掃描范圍為33～450 u，能量為70 eV。用Xcalibur軟件處理數據，未知化合物與NIST譜庫（包含107 000 種化合物）相匹配，僅報道正反匹配度均大于80的鑒定結果。

1.3.3 MFG粒徑、ζ電位測定

分別量取乳樣10 mL。用Mastersize 2000激光散射粒度分析儀測定MFG的粒徑和分布。MFG在466 nm和633 nm波長處的折光指數分別為1.460和1.458。顆粒吸收率0.1，遮光度10%～20%。

分別取乳樣10 μL，用蒸餾水稀釋1 000 倍體積，用Nano-Z Zeta電位儀在25 ℃條件下測定ζ電位。

1.3.4 MFG微觀結構觀察

分別取原料乳1 mL，向樣品中加入10 μL的尼羅紅，混合樣品，對乳樣中的中性脂質進行標記。將混合樣品室溫下避光放置30～40 min，將標記的樣品與5 g/L瓊脂糖（貯存在45 ℃）等量混合，將15 μL混合物取出至載玻片上，采用He-Ne激光器在488 nm與543 nm波長處激發尼羅紅熒光探針，使用63×1.4 倍的油鏡物鏡。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均進行3 次平行測定，結果以平均值±標準差表示。所得數據應用Excel、SPSS軟件計算平均值、方差及相關性，采用單因素方差分析法分析差異顯著性。采用Origin 8.5軟件和Excel軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 母乳與山羊乳功能性FA差異分析

2.1.1 母乳與山羊乳脂肪質量濃度

在嬰兒從出生到斷奶的喂養過程中，母乳中微量和宏量營養素組成都會隨母親的飲食習慣變化有所波動[12]。在乳的基本化學成分中，脂肪質量濃度的變化幅度最大[13]。母乳中脂肪質量濃度隨著泌乳期的延長顯著增加（P＜0.05），由初乳時的（26.7±3.6）g/L上升至過渡乳期的（33.7±4.6）g/L，又顯著增加至成熟乳期的（41.0±6.8）g/L。這與Martysiak-Zurowska等[13]的研究結果一致。山羊乳中脂肪質量濃度為（42.1±4.3）g/L，顯著高于母乳初乳和過渡乳（P＜0.05），但與成熟乳沒有顯著性差異。王風梅等[14]報道薩能奶山羊乳和荷斯坦牛乳中的脂肪質量濃度分別為40.4、35.5 g/L，陸東林等[15]報道山羊乳、牛乳、牦牛乳、綿羊乳、馬乳脂肪相對含量分別為4.5%、3.8%、6.5%、7.2%、1.6%，可以看出，與其他乳相比，牛乳和山羊乳脂肪相對含量與母乳最為接近。

2.1.2 母乳與山羊乳功能性FA組成分析

表1 母乳、山羊乳主要功能性FA的相對含量Table 1 Relative contents of major functional fatty acids in breast milk and goat milk%

母乳中功能性FA主要包括n-9、n-6和n-3多不飽和脂肪酸3 個系列。通過表1可以看出，母乳與山羊乳中主要功能性FA相對含量有很大不同，母乳中富含LA、α-亞麻酸（alpha-linolenic acid，ALA）、ARA、DHA和EPA，這幾種FA對降低嬰兒體內膽固醇含量、促進大腦與視力的發育等方面都具有重要作用，在母乳中的相對含量顯著高于山羊乳。油酸相對含量在母乳3 個泌乳期沒有顯著變化（P＞0.05），分別為32.27%、32.12%、30.53%，但是顯著高于山羊乳（20.79%）。LA相對含量在母乳初乳、過渡乳和成熟乳中分別為20.07%、19.76%、21.73%，在山羊乳中為4.43%，差異顯著（P＜0.05）。LA可降低嬰兒血液中膽固醇含量，其相對含量是評價FA營養價值的一個重要指標。ARA相對含量在初乳、過渡乳、成熟乳中相對含量分別為0.89%、0.71%、0.66%，在山羊乳中為0.15%，顯著低于母乳（P＜0.05）。對國內外幾種不同品牌的嬰兒配方奶粉中FA組成的研究發現，嬰幼兒配方奶粉中ARA相對含量在0.02%～0.67%之間[1,16]，與母乳比較，其相對含量嚴重不足。ARA是類花生酸的前體[17]，是參與調節免疫功能和血小板聚集的局部介質。所以，在設計研究山羊乳嬰幼兒配方奶粉配方時要注意ARA的補充。ALA相對含量在母乳成熟乳期最高（1.66%），而山羊乳中相對含量極少，僅為0.05%。對比母乳與山羊乳EPA相對含量發現，母乳中EPA相對含量在初乳期最高，為1.42%，顯著高于山羊乳（0.18%），可達山羊乳的7.8 倍。DHA相對含量在母乳的成熟乳中最低，為0.35%，是山羊乳的2.69 倍，其對于嬰幼兒神經系統的發育十分重要[18]。所以，在以山羊乳為基質的嬰幼兒配方奶粉中，應該強化ALA、EPA及DHA的相對含量。

2.2 母乳與山羊乳MFG物理特性分析

2.2.1 粒徑分析

脂肪球的粒徑是判斷乳濁液穩定性的重要指標，脂肪球粒徑越大穩定性越低。此外，MFG的粒徑對乳脂的消化吸收及營養價值也有一定的作用[19]。從表2可以看出，母乳不同泌乳期MFG粒徑發生改變，初乳MFG具有最大的體積平均粒徑（（5.63±0.51）μm），過渡乳期最小，為（4.21±0.35）μm，成熟乳期為（4.66±0.23）μm。然而，Rüegg等[20]報道，母乳MFG的體積平均粒徑隨著泌乳期的延長而增大，從初乳的1.74 μm增大到成熟乳中的4.10 μm，與本研究結果不同，這可能是飲食習慣、生活方式、人種不同等因素所致。山羊乳體積平均粒徑為（3.63±0.31）μm，比母乳小。文獻[21]報道，山羊乳MFG粒徑比母乳小，范圍在2.57～3.25 μm，與本研究結果一致。母乳初乳MFG粒徑不大于（4.87±0.34）μm和（9.87±0.31）μm的顆粒體積分數分別為50%、90%，高于過渡乳、成熟乳及山羊乳。

MFG粒徑影響乳的熱穩定性、起泡特性、膠凝行為和感官知覺[21-25]。山羊乳的MFG粒徑小，MFG不易聚集在一起，可以使乳脂肪穩定地分散在乳膠體溶液中，但是也反映出山羊乳脂肪分離難度比母乳大。從物理角度來看，根據拉普拉斯方程（ΔP＝4γ/d，其中：ΔP是曲面兩側之間存在的壓力差/Pa；γ是界面張力/（N/m）；d是顆粒的直徑/μm），在界面張力一定時，d越小ΔP越大，因此MFG在乳加工過程中被破壞的靈敏度取決于其粒徑，對于粒徑較大的MFG而言，其靈敏度會增加。在機械壓力下，山羊乳比母乳MFG具有更高的抵抗變形和聚結的能力。這可能有助于更好地了解乳制品生產過程中MFG的穩定性。

圖1 不同泌乳期母乳及山羊乳MFG的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of breast milk fat globules at different lactation stages and goat milk fat globules

從圖1可以看出，母乳與山羊乳的粒徑均呈正態分布。母乳不同泌乳期MFG粒徑分布范圍差異明顯。初乳、過渡乳和成熟乳MFG粒徑分布范圍分別為0.63～39.91、0.44～13.46 μm和0.79～18.37 μm。初乳粒徑分布較寬，過渡乳和成熟乳具有較窄的粒徑分布；山羊乳的粒徑分布范圍為0.48～15.88 μm，窄于初乳和成熟乳。Truong等[22]也報道了類似的結果。母乳初乳和成熟乳都有兩個峰，這意味著這兩個時期的母乳可能含有兩組MFG[26-27]。在乳中不同粒徑的MFG具有不同的化學成分，特別是Argov等[27]報道的一些亞微米小球，具有新的代謝和營養功能。不同哺乳階段母乳MFG的粒徑及分布不一致可能與各階段嬰兒生長的特定需求有關。

2.2.2 ζ電位分析

ζ電位可以反映體系中顆粒的帶電性和顆粒之間相互作用的強弱，是反映MFG穩定性的重要表征之一，ζ電位（正或負）越高，體系越穩定。自然狀態下母乳MFG表面呈負電勢，母乳表面電位在初乳期最低（（-5.72±0.21）mV），過渡乳和成熟乳ζ電位分別為（-6.53±0.27）、（-7.76±0.23）mV。隨著泌乳時間的延長，ζ電位顯著增加（P＜0.05）。山羊乳ζ電位為（-13.69±0.27）mV，顯著高于母乳3 個泌乳期（P＜0.05）。不同哺乳期或來自不同物種MFG的ζ電位差異很大程度上歸因于MFG膜中極性脂質磷脂、蛋白質和礦物質等含量的不同[28]。

2.3 母乳與山羊乳MFG的微觀結構

圖2 尼羅紅染色觀察不同泌乳期母乳及山羊乳MFG中甘油三酯的微觀結構Fig. 2 Microstructure of triacylglycerols in human colostrum,transitional, mature milk and goat MFG stained with a Nile Red fluorescent probe

由圖2可以看出，母乳與山羊乳MFG均為球狀，形態完整，以液滴的形式分散于乳中，紅色部分為尼羅紅熒光探針染色后呈現的MFG結構，在相同倍數油鏡的觀察下，母乳不同泌乳期及山羊乳MFG的密度和粒徑不同，每毫升原料乳中，山羊乳的MFG顆粒數較多，可以說明山羊乳MFG較小，而母乳初乳MFG體積大于過渡乳和成熟乳。由于樣品乳沒有經過高壓均質等處理，因此可以看到MFG粒徑不均一，小的MFG發生了聚集，大的MFG周圍吸附有小MFG。此外，尼羅紅可通過MFG膜染色小MFG核心中的TAG，表明MFG膜具有一定的滲透性，可以允許一些分子通過。因此，如果小MFG的結構沒有受到機械或熱損傷，TAG應完全位于脂肪球的核心。

2.4 母乳與山羊乳各指標相關性分析

如表3所示，乳中MFG的ζ電位與脂肪質量濃度呈正相關。隨著泌乳期的延長，脂肪質量濃度顯著增加，MFG表面電位也顯著升高。來自不同哺乳期或來自不同物種MFG的ζ電位差異很大程度上歸因于MFG膜中極性脂質、蛋白質及存在于水性環境中礦物質含量的不同[28]，同時，與乳中脂肪質量濃度也有一定的相關性。乳中MFG粒徑和脂肪質量濃度也呈正相關，其中山羊乳MFG體積平均粒徑與脂肪質量濃度間相關性系數可達0.887（P＜0.05）。Ménard等[29]研究發現水牛和荷斯坦牛乳MFG粒徑和脂肪含量也存在相關性（線性相關）。不同乳源MFG體積平均粒徑與LA相對含量都呈正相關，但相關性不完全一致，成熟乳中其相關系數為0.945，相關性極顯著（P＜0.01），但過渡乳和山羊乳中相關性不顯著。不同泌乳階段大、小MFG的組成成分不同，MFG的結構、組成、泌乳階段、FA相對含量、脂肪質量濃度之間的相關性也并不完全一致，這可能是個體差異導致的，FA組成與脂肪結構之間的相互作用還有待進一步研究。

表3 母乳與山羊乳中主要功能性FA相對含量、MFG粒徑、ζ電位及脂肪質量濃度之間的相關性Table 3 Correlation between relative contents of major functional fatty acids and average particle size of MFG, zeta-potential and fat content in breast milk and goat milk

3 結 論

本研究結果顯示，母乳與山羊乳中功能性FA及MFG物理特性存在明顯差異，母乳初乳、過渡乳、成熟乳和山羊乳中脂肪質量濃度分別為（26.7±3.6）、（33.7±4.6）、（41.0±6.8）、（42.1±4.3）g/L。母乳中主要功能性FA LA、ALA、ARA、EPA和DHA相對含量顯著高于山羊乳（P＜0.05）。其中ALA相對含量在母乳成熟期達到最高，為1.66%，而山羊乳中僅為0.05%。母乳與山羊乳粒徑分布均為正態分布，并且觀測到完整的MFG結構。母乳初乳MFG具有最大的體積平均粒徑（（5.63±0.51）μm）和最低的ζ電位（（-5.72±0.21）mV）。山羊乳MFG體積平均粒徑（（3.63±0.31）μm）小于母乳，而ζ電位（（-13.69±0.31）mV）顯著高于母乳（P＜0.05），FA相對含量、MFG粒徑、ζ電位及脂肪相對含量之間有一定的相關性。因此，在以山羊乳為基質的嬰幼兒配方奶粉中應該注意主要功能性FA相對含量以及MFG的結構調整，尤其應該注意增加ARA、EPA、DHA的相對含量。