42份云南玉米自交系基于SSR熒光標記的遺傳多樣性分析

張 鵬，管俊嬌，黃清梅，王江民，楊曉洪，劉艷芳，張建華，毛 進

(云南省農業科學院 質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205)

玉米是我國重要谷物，栽培歷史已有470多年，根據歷年我國玉米的播種面積和產量情況，玉米已成為中國第一大糧食作物[1]。現今全世界約有三分之一人口以玉米作為主要食糧，其中亞洲人的食物組成中玉米占50%，世界范圍內對玉米育種及應用研究非常廣泛，玉米種質資源也不斷推陳出新，就目前我國玉米審定品種數量已多達6000余個[2]。云南地處西南，擁有獨特的氣候環境，生長季與光熱水同季，玉米是云南地區的主要糧食作物[3]，近些年來云南省一直在提倡發展高原特色農業，面對目前玉米品種種質資源的與日俱增，對高原特色玉米遺傳種質的來源、系譜關系及遺傳差異的分析和掌握程度，是選育優良品種的基礎[4]，也是品種管理的需要，同時還能為提高品種質量和價值，避免玉米品種親緣關系混雜，規范玉米品種市場提供有力的科學理論支撐。

簡單序列重復(Simple Sequence Repeat，SSR)標記是建立在聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)基礎上的一種目前較為成熟的遺傳分子標記，已有效應用于玉米遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、聚類分析和基因鑒定等領域[5-7]，但常規的SSR標記存在工作量大、精度低、分析量小等缺點，已無法滿足目前的試驗要求。許鯤等通過40對SSR熒光引物構建了我國163份冬油菜指紋圖譜[8]。Sanchez-Perez等曾探討過關于瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管熒光電泳這3種技術各自的優劣，最終得到聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細管電泳比瓊脂糖凝膠電泳更具有優勢[9]。劉歡等利用熒光檢測技術對多花黑麥草進行了EST-SSR指紋圖譜的構建，通過研究表明，目前的檢測方法都各有優缺點，要根據不同的試驗階段按實際需求選擇合適的檢測技術[10]。綜合3種檢測技術，SSR熒光標記技術具有簡單易行、精度高、通量大等優點[11-12]，為大數據的分析提供了可能。

因此，本研究采用毛細管熒光標記技術，對收集的42份云南高原地區常用玉米自交系品種遺傳多樣性進行數據挖掘和系統分析，旨在為高原玉米種質創新、品種遺傳改良、評估育種群體遺傳多樣性等育種工作提供技術支撐[13]，同時也為構建指紋圖庫，進一步對品種進行規范化管理等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的42個自交系均為云南常用自交系品種，其中28個為近幾年新育成自交系，具體品種信息和品種權授權情況見表1。另外14個為參照自交系，主要為已經公用公知的自交系品種，具體信息和系譜信息見表2。42個自交系品種使用人工氣候箱育苗，將需要試驗的種子在人工氣候箱中進行育苗，設計3個重復，每個重復30株，待幼苗生長到3葉1心時，開始取樣，取樣從3個重復中分別進行單株取樣，共取10個單株進行之后的試驗。

表1 新育成自交系信息

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 在玉米苗期，每個品種取5片幼嫩葉片在液氮下混合研磨，采用CTAB法提取DNA。利用紫外分光光度計檢測提取DNA質量并用超純水稀釋，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 引物的篩選 根據現行的玉米品種鑒定DNA指紋方法(NY/T 1432─2007)推薦的40對核心引物，通過正交試驗設計從中篩選出30對用于本試驗，并且擴增條帶清晰、重復性好、多態性豐富的引物進行試驗，引物相關信息見表3。

1.2.3 PCR擴增 PCR擴增反應體系與現行的玉米品種SSR標準(NY/T 1432─2007)技術參數進行了優化，具體如下：反應體系優為10L，2L緩沖液優化為1L，2L MgCl2優化為0.6L MgCl2或不加，dNTP溶液由1.2L優化為0.8L，Tag DNA聚合酶由0.2L優化為0.25L，檢測樣品DNA由2L優化為1L。如若不加入MgCl2則以等量的去無菌水代替。

反應采用下列程序：94 ℃預變性5 min，1個循環；30次擴增反應循環(94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。形成的擴增產物于4 ℃下保存。

表2 參照自交系品種系譜信息

1.2.4 熒光標記檢測 利用遺傳分析儀進行熒光毛細管電泳，并使用DNA Collection Software 軟件收集原始數據。引物和熒光標記、Tag DNA聚合酶和dNTP等試劑購自上海生工生物技術有限公司。使用Gene Mapper軟件對基因片段進行分析。

1.3 數據分析與統計

試驗結果主要進行基因型的數據統計，擴增產物按“0、1、-”進行統計分析，相同位置上，有條帶標記為“1”，無條帶標記為“0”，數據缺失標記為“-”。數據分析使用NTsys2.11和Excel軟件來進行分析統計，并計算遺傳相似系數，非加權組平均法(UPGMA,Unweight Pair Group Method Using Arithmetic Averages)進行遺傳聚類分析。參照多態性信息量(Polymorphism Information Content)計算PIC值[14]。

2 結果與分析

2.1 云南42份常用玉米自交系SSR標記多態性分析

通過利用30對引物對42份云南常用玉米自交系進行試驗，共檢測到277個等位基因變異，平均每個位點檢測到的等位基因數為9.2個，變化范圍4～17個，片段大小介于86～434 bp之間，每個SSR位點的多肽信息量(PIC)在0.7008～0.9979之間，平均為0.9712，其中引物bnlg1191的PIC最大為0.9979，引物umc1335y5的最小，為0.7008，但有的位點(如bnlg1671y17)等位基因數目較多，而PIC值卻較低，有的位點等位基因較少，PIC值相對較高(如bnlg490y4)，具體信息見表3。本研究中使用的30對SSR引物均勻分布在全部染色體上，都具有較高的多態性，能夠較好地反映出供試材料之間的遺傳差異及遺傳多樣性。圖1為掖502、中106、鐵7922、JC6181四個品種在引物bnlg1191的擴增帶型。

表3 42份云南常用玉米自交系等位基因數和多態信息含量

2.2 云南42份常用玉米自交系遺傳多樣性分析

通過聚類結果(圖1)顯示，42個自交系遺傳相似系數均大于0.82，具體類群劃分不明顯，大部分品種遺傳相似度較高，說明不同育種單位或育種人在品種選育時所采用的親本材料遺傳基礎較狹窄，不同材料分散于不同小類群中，其中F880、NP5203、Y708M為來源不同的相同品種，最終聚到了一起，但遺傳相似系數不高，說明這些品種還存在品種內的差異。其中TRL2與C8605-2最為相似，遺傳相似系數達到了0.98，主要考慮到引物的原因無法區分，或是因為品種血緣相近的姊妹系。綜31、齊318、本7884-7、鐵7922和U8112均為美國優良自交系品種，但鐵7922和U8112分為一類，其余3個品種為一類。JC6181和中106與其他品種分開，JC181的遺傳背景不詳，而且沒有通過品種授權，中106則屬于塘四平頭類群，但與其他塘四平頭類群的品種，例如黃早4和掖502沒有劃分為一類，具體原因還有待進一步分析。

圖1 4個品種在引物bnlg1191的擴增帶型

3 結論與討論

由于玉米屬于異花授粉植物，遺傳多樣性越高，遺傳差異越大，得到高雜種優勢的可能性越大。研究玉米品種的遺傳多樣性是選育優良品種的基礎，在玉米種質創新和利用工作中具有重要意義[15-16]。但由于目前大部分的品種都由骨干自交系而來，加上在環境壓力和人為選擇導致同一單位選育的品種遺傳相似度較高，品種遺傳多樣性不夠豐富，云南省豐富資源還沒有被完全挖掘利用[17]，導致新育成的玉米品種遺傳背景相似、血緣關系相近，不利于品種的創新和種業的發展，因此需要在自交系的有效利用、品種資源評價、共享和交流等方面開展相關工作。

應用SSR標記對42份云南常用玉米自交系的遺傳多樣性進行分析，通過遺傳距離聚類綜合分析，可對42份玉米自交系進行類群劃分，進一步明確所用種質資源的雜優類群利用方向，為玉米新種質的創制和玉米新品種的選育提供理論依據。