胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)對(duì)小鼠卵丘細(xì)胞自噬與胞吞相關(guān)因子表達(dá)的影響

馬 睿，潘陽(yáng)陽(yáng)，王 萌，李 秦，何翃閎，胡學(xué)權(quán)，趙 凌，王靖雷，崔 燕，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色，與卵母細(xì)胞形成卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus oocyte complexes, COCs)，通過(guò)縫隙連接方式與卵母細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。相關(guān)研究表明，卵丘細(xì)胞的自噬活動(dòng)可作為影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的因素之一，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育和胚胎的形成至關(guān)重要[3]。mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞自噬調(diào)控的關(guān)鍵使者[4]，mTOR信號(hào)通路受到抑制可降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量[5-7]，影響卵母細(xì)胞發(fā)育。胞吞作為細(xì)胞生長(zhǎng)的又一關(guān)鍵生理程序，可通過(guò)小窩蛋白與胰島素受體(Ins-R)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、G蛋白α亞基、蛋白激酶C(PKC)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)及Src家族等多種蛋白相互作用，參與細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物事件，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與質(zhì)量[8]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞受到外界刺激時(shí)可啟動(dòng)細(xì)胞自噬維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定，也可清除細(xì)胞內(nèi)的異常組分[9]。自噬正常生理功能的發(fā)揮需要自噬蛋白與多種活性酶的結(jié)合，從而消化降解異常物質(zhì)，更新胞內(nèi)物質(zhì)，傳遞能量，維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬過(guò)程中自噬相關(guān)基因5(Autophagyrelated gene 5，Atg5)可與Atg12蛋白結(jié)合， Atg12-Atg5和Atg16蛋白連接形成一個(gè)Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物，在自噬體形成早期起重要作用[10]。Beclin1可與 3-磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)形成Beclin1/PI3K復(fù)合物，募集Atg8，最終促進(jìn)自噬體膜的生成。而微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)可靶向定位于自噬體膜，促進(jìn)自噬體的形成，對(duì)細(xì)胞自噬的完成具有重要調(diào)控作用[11-12]。胞吞主要是細(xì)胞與外界物質(zhì)交換的主要模式，通過(guò)Caveolin1(Cav1)和Caveolin2(Cav2)蛋白在細(xì)胞膜形成細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷，通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層融合包裹外源成分，形成獨(dú)立的囊泡后完成物質(zhì)運(yùn)輸以攝取外界營(yíng)養(yǎng)[13-14]。綜上，Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2表達(dá)的檢測(cè)可作為細(xì)胞自噬與胞吞調(diào)控的重要指標(biāo)。最新研究發(fā)現(xiàn)，在人小梁網(wǎng)細(xì)胞和人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞及組織的基底細(xì)胞中，Cav1蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞和自噬活動(dòng)，敲除Cav1蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的自噬[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)T淋巴細(xì)胞中自噬蛋白也可調(diào)節(jié)受體Amyloid precursor protein(APP)的內(nèi)吞作用[16]。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明自噬相關(guān)蛋白和胞吞相關(guān)蛋白的功能之間存在緊密聯(lián)系，研究它們的作用方式十分必要。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factor，IGF-1)作為細(xì)胞生長(zhǎng)、卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的重要調(diào)控因子，廣泛分布于卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)等組織[17]。在裸鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，IGF-1可抑制由于血清缺乏及營(yíng)養(yǎng)匱乏等不利因素所導(dǎo)致的細(xì)胞自噬和細(xì)胞死亡，并且證明IGF-1是通過(guò)作用于AKT通路影響細(xì)胞自噬[18]。IGF-1可在多種類(lèi)型的組織細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞自噬，如骨腫瘤細(xì)胞和血管細(xì)胞等。有研究表明，胰島素受體-1(IRS-1)與Cav1蛋白之間有很重要的互作[19]，說(shuō)明IGF-1對(duì)細(xì)胞自噬和胞吞都有重要的作用，但目前未見(jiàn)IGF-1對(duì)哺乳動(dòng)物卵丘細(xì)胞自噬和胞吞調(diào)控的報(bào)道。

本研究在小鼠卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中分別添加0、50、100、150和200 ng/mL IGF-1，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡(Western-blot,WB)等方法分別從基因和蛋白水平檢測(cè)IGF-1對(duì)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2表達(dá)的影響，探索IGF-1參與小鼠卵丘細(xì)胞自噬和胞吞的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究生長(zhǎng)因子參與動(dòng)物生殖相關(guān)細(xì)胞自噬與胞吞作用，及其對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雌性昆明小鼠購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。在飼養(yǎng)和試驗(yàn)過(guò)程中，遵守清潔級(jí)動(dòng)物管理規(guī)定，控制環(huán)境溫度在26 ℃，注意通風(fēng)，定期更換墊料和籠具，自由采食和飲水。

1.2 主要試劑

DMEM F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，青、鏈霉素，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；IGF-1、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶等購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。微量RNA 提取試劑盒(Promega, 美國(guó))、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國(guó))、SYBR GreenⅡ熒光定量PCR 試劑盒(寶生物，大連)，免疫熒光檢測(cè)及蛋白免疫印跡所用試劑均購(gòu)買(mǎi)于南京碧云天生物公司，蛋白免疫印跡所用抗體均購(gòu)于博奧森公司(北京)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，包括PBS(索萊寶，北京)和甲醇(大茂，天津)等。

1.3 主要方法

1.3.1 小鼠卵丘細(xì)胞的收集及培養(yǎng) 選取發(fā)育正常且健康狀況良好的6～8周齡雌性昆明(KM)小鼠，于18:00每只注射PMSG 8 IU，間隔24 h后腹腔注射HCG 10 IU，12 h后，將小鼠脫頸處死，分離輸卵管，在體式顯微鏡下用鑷子撕開(kāi)輸卵管膨大部，使卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體游離于生理鹽水中，在體視顯微鏡下挑選有至少3 層致密卵丘細(xì)胞包裹卵母細(xì)胞的復(fù)合體，透明質(zhì)酸酶消化(1 min)，然后用自制玻璃吸管均勻用力反復(fù)吹打卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離。將分散的卵丘細(xì)胞收集到提前配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液中，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，重復(fù)2次后再用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。培養(yǎng)液為：DMEM/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+150 g/L FBS。

1.3.2 免疫熒光檢測(cè)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白 待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，取第3代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，吹打均勻并調(diào)至合適密度(1×104mL-1)，取200 μL懸液滴加于六孔板中的無(wú)菌蓋玻片上，于37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱靜置20 min后加入2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿六孔板中無(wú)菌玻片的80%左右時(shí)，PBS洗3遍(每次5 min)；每孔加入1 mL的4 g/L多聚甲醛，室溫固定1 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；每孔細(xì)胞加入1 mL 0.05 g/L的Triton X- 100，室溫孵育1 h，PBS精洗3遍(每次5 min)；每孔加入1 mL 10 g/L的BSA，室溫封閉2 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；一抗(Rabbit Anti-Atg5，Rabbit Anti-Beclin1，Rabbit Anti-LC3，Rabbit Anti-Cav1，Rabbit Anti-Cav2)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3遍(每次5 min)；二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)室溫避光孵育2 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；1 μg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′- 6- diamidino- 2- phenylin-dole, DAPI)染色3 min，PBS清洗3遍(每次5 min)；抗熒光猝滅劑封片，在奧林巴斯熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.3.3 IGF-1處理小鼠卵丘細(xì)胞 待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，取第4 代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，調(diào)至合適密度(1×105mL-1)后接種至六孔板，分別加入質(zhì)量濃度為0、50、100、150和200 ng/mL 的培養(yǎng)液。放入恒溫箱培養(yǎng)48 h后處理細(xì)胞，備用。

1.3.4 總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗3遍，用微量RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.5Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2基因表達(dá)檢測(cè) 使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL， Nuclease-Free 水 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s； 95 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)重復(fù)。引物信息見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Information of primers used in qRT-PCR

1.3.6 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白表達(dá)檢測(cè) 用PBS清洗卵丘細(xì)胞3次，加入蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，10 000 r/min離心15 min，收集上清，置于-80 ℃冰箱保存。沉淀中加入4×SDS上樣緩沖液，100 ℃金屬浴15 min使蛋白充分變性。以10 μL上樣量進(jìn)行電泳，電泳后通過(guò)濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉3 h，一抗4 ℃過(guò)夜，PBST(PBS + tween-20)清洗 5 min，重復(fù)6次，二抗室溫孵育1 h，PBST清洗3遍，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒曝光2～5 min，待蛋白條帶清晰時(shí)拍照分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用2-△△Ct公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，WB結(jié)果利用Image Pro Plus軟件測(cè)定蛋白條帶的IOD值，根據(jù)IOD值分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量(蛋白表達(dá)量=目的IOD/內(nèi)參IOD)。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，每組至少重復(fù)3次，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，使用Graphpad prism 5.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠卵丘細(xì)胞的分離培養(yǎng)

卵丘細(xì)胞采用直接接種貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的卵丘細(xì)胞以1×105mL-1的初始密度被接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，8 h后，部分細(xì)胞由圓形向兩頭伸展成梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間有絲狀聯(lián)系。1 d后，細(xì)胞表面出現(xiàn)數(shù)個(gè)不規(guī)則的突起，突起部分相互接觸并開(kāi)始匯合，此時(shí)細(xì)胞間有大片間隙。2 d后細(xì)胞間空隙大幅減少，細(xì)胞呈多邊形大量貼壁生長(zhǎng)。3 d后細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，匯合成單層將瓶底鋪滿，之后出現(xiàn)接觸抑制。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右即可傳代， 3～4 d傳代1 次。培養(yǎng)過(guò)程中可在培養(yǎng)液的顏色變黃后給細(xì)胞換液。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在含150 g/L FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)旺盛，6 h即可見(jiàn)到細(xì)胞貼壁。傳代細(xì)胞在早期也呈長(zhǎng)梭形，后期出現(xiàn)不規(guī)則多邊形(圖1)。

圖1 第3代小鼠卵丘細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)(100×)Fig.1 Growth pattern of mouse cumulus cells of the third generation (100×)

2.2 卵丘細(xì)胞中Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白的分布

對(duì)小鼠卵丘細(xì)胞進(jìn)行Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)的小鼠卵丘細(xì)胞內(nèi)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白均有表達(dá)，主要表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)(圖2)。

2.3 IGF-1對(duì)小鼠卵丘細(xì)胞 Atg5、 Beclin1、 LC3、 Cav1和 Cav2基因表達(dá)的影響

研究結(jié)果顯示(圖3)，與對(duì)照組相比，各處理組自噬相關(guān)基因Atg5mRNA的表達(dá)量均增大，當(dāng)IGF-1質(zhì)量濃度為150 ng/mL時(shí)，Atg5mRNA表達(dá)水平最高，與其他處理組差異顯著；50和150 ng/mL IGF-1顯著抑制Beclin1、LC3mRNA的表達(dá)，但100和200 ng/mL IGF-1對(duì)Beclin1、LC3mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響；50和200 ng/mL IGF-1顯著抑制胞吞基因Cav1和Cav2的表達(dá)；與50 ng/mL處理組相比，100和150 ng/mL處理組Cav1、Cav2mRNA的表達(dá)量有回升趨勢(shì)。

紅色熒光為Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白 Red fluorescence: Atg5，Beclin1，LC3，Cav1 and Cav2 protein respectively;藍(lán)色熒光為細(xì)胞核 Blue fluorescence: cell nucleus

圖2 細(xì)胞自噬與胞吞相關(guān)蛋白在小鼠卵丘細(xì)胞的定位
Fig.2 Localization of autophagy and endocytosis-associated proteins in cells of mouse cumulus

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01),下同 Lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)，uppercase letters indicate significant differences (P<0.01),the same below

圖3 IGF-1處理下小鼠卵丘細(xì)胞Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2基因的表達(dá)量
Fig.3 Expression ofAtg5,Beclin1,LC3,Cav1andCav2genes in mouse cumulus cells under IGF-1 treatment

2.4 IGF-1對(duì)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白表達(dá)的影響

研究結(jié)果顯示(圖4，圖5)，與對(duì)照組 (0 ng/mL)相比，IGF-1刺激ATG5蛋白表達(dá)，抑制Beclin1和LC3表達(dá)，且在100 ng/mL時(shí)最低。此時(shí)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也最低，該比值是評(píng)估自噬水平高低的重要標(biāo)志，比值越小說(shuō)明細(xì)胞自噬水平越低。50和200 ng/mL IGF-1顯著抑制Cav1和Cav2蛋白的表達(dá)；但與50 ng/mL處理組相比，100和150 ng/mL處理組Cav1和Cav2 蛋白的表達(dá)量有回升趨勢(shì)，特別是Cav2蛋白在150 ng/mL作用下表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。

3 討 論

本研究分別從基因水平和蛋白水平檢測(cè)不同質(zhì)量濃度IGF-1因子對(duì)小鼠卵丘細(xì)胞自噬和胞吞活動(dòng)的影響。分析自噬相關(guān)的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：在IGF-1作用下，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量顯著降低，表明細(xì)胞內(nèi)自噬水平降低。當(dāng)IGF-1質(zhì)量濃度為100 ng/mL時(shí)，LC3Ⅱ蛋白及LC3Ⅱ/LC3I均顯著降低且降至最低，說(shuō)明此時(shí)IGF-1對(duì)小鼠卵丘細(xì)胞自噬的抑制效果最好。Beclin1基因存在選擇性剪接的現(xiàn)象[20]，且Beclin1蛋白與Bcl-2蛋白為互作蛋白，常以復(fù)合體的形式存在[21]。有研究發(fā)現(xiàn)Beclin1還與Vps34結(jié)合形成蛋白復(fù)合體[22]，在自噬體形成階段發(fā)揮重要作用，這可能導(dǎo)致Beclin1基因與蛋白檢測(cè)結(jié)果有差異，具體原因需進(jìn)一步研究。在IGF-1各個(gè)處理組，Atg5 mRNA和蛋白的表達(dá)量均高于對(duì)照組(0 ng/mL)，可能是由于IGF-1對(duì)于自噬起始階段有一定的抑制作用，Atg5主要在自噬誘導(dǎo)階段起作用，并與Atg12和Atg16蛋白形成復(fù)合體以促進(jìn)自噬泡的延伸，IGF-1對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用可能導(dǎo)致自噬泡延伸過(guò)程受阻，Atg5蛋白在體內(nèi)累積，由此出現(xiàn)表達(dá)量增大的現(xiàn)象。此時(shí)另外兩種自噬相關(guān)蛋白Beclin1和Lc3的表達(dá)量均下降，證明自噬誘導(dǎo)階段被抑制的可能性 極大。

1～5.IGF-1質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200 ng/mL IGF-1 mass concentration is 50 ng/mL,100 ng/mL,150 ng/mL and 200 ng/mL

圖4 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1、Cav2和β-actin蛋白的表達(dá)
Fig.4 Expression of Atg5, Beclin1, LC3,Cav1, Cav2 and β-actin proteins

圖5 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白的相對(duì)表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3IFig.5 Relative expression levels of Atg5, Beclin1, LC3, Cav1 and Cav2 proteins,LC3Ⅱ/LC3I

Cav在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量不同：Cav1在高分化的細(xì)胞中呈高表達(dá)，如脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，Cav2與Cav1通常共表達(dá)，且Cav2必須與 Cav1 結(jié)合形成低聚物才能定位至小窩，Cav2與胰島素抵抗過(guò)程密切相關(guān)[23]。通過(guò)胞吞相關(guān)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：IGF-1可調(diào)控Cav1和Cav2的表達(dá)，WB結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 ng/mL)相比，IGF-1質(zhì)量濃度為50 ng/mL和200 ng/mL時(shí)，Cav1和Cav2的表達(dá)均顯著降低；但在100～150 ng/mL時(shí)，Cav1和Cav2的表達(dá)量表現(xiàn)出回升趨勢(shì)。說(shuō)明隨著IGF-1質(zhì)量濃度的增大，Cav1和Cav2蛋白的表達(dá)量變化趨勢(shì)不是單一的上升或者下降，IGF-1對(duì)其表達(dá)的調(diào)控方式較為復(fù)雜，并不是簡(jiǎn)單的抑制或者促進(jìn)作用。

前人研究結(jié)果表明，通常膜受體是在細(xì)胞膜上的脂筏和質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)中介導(dǎo)跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，IGF-1受體定位于脂質(zhì)筏和質(zhì)膜微囊中，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴(lài)于細(xì)胞膜上完整的脂筏和質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)，且 IGF-1 受體可以直接和Cav1相互作用[24-26]。脂筏和質(zhì)膜微囊主要在受體激活下游信號(hào)分子的過(guò)程中起作用，而受體本身被配體激活的過(guò)程并不需要脂筏和質(zhì)膜微囊的參與，這說(shuō)明細(xì)胞膜上的IGF-1受體定位于脂質(zhì)筏和質(zhì)膜微囊中，使得受體和集聚在脂筏/質(zhì)膜微囊的下游信號(hào)分子復(fù)合體相互靠近，并通過(guò)這些復(fù)合體進(jìn)行信號(hào)的傳遞[27]。基于以上理論可看出，IGF-1作用于細(xì)胞后的確引起Cav1和Cav2蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步說(shuō)明IGF-1因子在小鼠卵丘細(xì)胞的胞吞活動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中可能起重要調(diào)控作用，但其調(diào)節(jié)Cav1和Cav2蛋白的具體機(jī)制及作用方式尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

自噬和胞吞作用強(qiáng)弱均和 IGF-1 質(zhì)量濃度相關(guān)，說(shuō)明IGF-1可調(diào)控小鼠卵丘細(xì)胞自噬及胞吞生理活動(dòng)，但是小鼠卵丘細(xì)胞中自噬和胞吞之間的聯(lián)系尚不清楚。已有研究表明Cav蛋白參與多種生理過(guò)程中的分子互作[28]，并且發(fā)現(xiàn)在肺上皮細(xì)胞中Cav1可以通過(guò)與Atg-5和Atg-12形成的復(fù)合物作用而調(diào)節(jié)自噬[29]，本研究發(fā)現(xiàn)，在IGF-1質(zhì)量濃度為50～100 ng/mL時(shí)，Cav1和Cav2蛋白的表達(dá)水平均顯著增加，Beclin1和LC3I的表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3I均顯著增大，表明此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)IGF-1對(duì)自噬和胞吞調(diào)控呈正相關(guān)；但在IGF-1質(zhì)量濃度為100～200 ng/mL時(shí)，Cav1蛋白的表達(dá)水平下降，LC3的表達(dá)上升，此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，IGF-1對(duì)自噬和胞吞的調(diào)控呈負(fù)相關(guān)。Cav1有破壞Atg5和Atg12復(fù)合物的功能，從而抑制細(xì)胞自噬[30]。筆者發(fā)現(xiàn)在 100～150 ng/mL時(shí)，Cav1和Cav2的表達(dá)量表現(xiàn)出回升趨勢(shì)，此時(shí)細(xì)胞自噬抑制效果最為明顯，進(jìn)一步表明細(xì)胞的自噬和胞吞存在一定關(guān)聯(lián)，但其具體的作用機(jī)制仍需探索。

4 結(jié) 論

首次證實(shí)在小鼠卵丘細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí)，IGF-1可調(diào)控Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2的表達(dá)，進(jìn)一步表明IGF-1參與動(dòng)物細(xì)胞自噬與胞吞的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬和胞吞強(qiáng)度與IGF-1因子的作用質(zhì)量濃度有關(guān)，且自噬與胞吞之間具有一定聯(lián)系。本研究對(duì)生長(zhǎng)因子調(diào)控卵丘細(xì)胞的自噬與胞吞，及卵母細(xì)胞質(zhì)量與發(fā)育能力等方面研究可資借鑒。