電子順磁共振技術在藥學實驗中的應用探索

趙淑銳，鄭美青，吳英婷，王耀楠

電子順磁共振技術在藥學實驗中的應用探索

趙淑銳，鄭美青，吳英婷，王耀楠

（首都醫科大學 中心實驗室，北京 100069）

電子順磁共振（ESR）技術是檢測單電子的唯一的直接分析方法，該文將這種方法應用到了藥學專業實驗教學中。通過NO自由基的清除實驗教學，不僅使學生直接接觸了現代大型電子順磁共振儀，熟悉了NO自由基的產生、捕捉機理及清除方法，還培養了學生的科研思維，形成了藥學專業人才培養特色，提高了學生的綜合實驗技能。

藥物化學實驗；電子順磁共振儀；一氧化氮自由基

在藥學相關的實驗教當中，知識體系構建對學生科研思維形成具有非常重要的作用，有助于學生從連續性的實驗中認識藥物化學的發展過程，培養科研型思維[1]。針對“藥學專業實驗II”[2-3]，本文利用藥學儀器平臺的大型儀器，建立了新的自由基清除模型，開發了新的自由基清除方法，完善了藥學專業實驗教學內容。該項實驗教學，旨在使學生掌握這項新技術，并將其運用到自由基清除劑新藥研究工作中[4-7]。

自由基是含有未成對電子的原子基團，化學性質非常活潑，容易失去或得到電子發生氧化還原反應，在體內的多種疾病發生、發展過程中扮演重要角色。由于自由基非常活潑，在檢測過程中如果操作不及時，就會導致自由基淬滅而失去檢測機會。因此快速準確檢測自由基，對于監測疾病發生、發展過程尤為重要。

電子順磁共振（ESR）是直接檢測和研究含有未成對電子的順磁性物質的一種現代分析方法[8]，也是檢測單電子唯一的直接方法，具有靈敏度高、無干擾、樣品不受破壞等優點，是目前檢測自由基最直接、最有效的方法之一[9]。電子順磁共振儀是針對自由基單電子設計的大型儀器，用其研究生物體內自由基的釋放與清除是目前科學研究的前沿熱點。

1 自由基清除實驗設計背景及實驗的可行性

NO自由基具有重要的生物功能，是內皮細胞松弛因子，能抑制血小板凝聚，由于是自由基，因此具有自由基的兩面性。除了生物功能外，它還具有反應性強和細胞毒性的一面，對心血管既有保護作用又可能有損傷作用[10]，體內NO產生過多可導致內皮細胞損傷和死亡。近年來,人們相繼發現某些血管性疾病和神經功能性障礙，如高血壓、心血管疾病、糖尿病、肺及腎病、男性性功能障礙等[11]，都伴有NO異常。

“藥學專業實驗II”是圍繞化合物2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉、2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉的合成、鑒定及生物活性評價展開的[2-3]。有文獻報道，目標化合物能有效清除NO自由基[12]，保護血管內皮細胞免受自由基攻擊。

2 NO自由基的清除實驗設計

任務：藥物的生物活性評價——NO自由基的清除。

儀器：JEOL FA-300電子順磁共振儀、移液槍、EP管、分析天平、玻璃毛細管（0.9~1.1 mm）、封口膠、順磁管。

試劑：七水合硫酸亞鐵（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP，≥97%，sigmsa）、N-(Dithiocarbamoyl)-N-methyl-D-glucamine sodium salt(MGD,dojindo)、超純水自制。

被測樣品：2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉和2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉的分子結構見圖1和圖2。

圖1 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉分子結構

圖2 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉

樣品測試條件：掃描時間1 min、中心磁場330 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調制寬度0.35 mT。

實驗目的：測定化合物的ESR圖譜以及化合物對NO自由基的清除作用。

3 實驗過程

3.1 概述

將所需測試的樣品溶液（10–4mol/L）虹吸入石英毛細管中，外加石英樣品保護管。放入ESR波譜儀的諧振腔中測定樣品圖譜（見圖3、圖4）。

NO自由基捕捉清除實驗采用S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）作為NO自由基的供體，不斷釋放NO，用亞鐵鹽和N-甲基-D-葡萄糖胺（MGD）的絡合物捕捉NO自由基而形成(MGD)2-Fe2+-NO復合物。(MGD)2-Fe2+-NO復合物ESR圖譜如圖5所示。NO自由基的捕捉體系如下：

2MGD + Fe2+(MGD)2-Fe2+

圖3 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-氧基咪唑啉ESR圖譜

圖4 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-二氧基咪唑啉ESR圖譜

圖5 (MGD)2-Fe2+-NO復合物ESR圖譜

3.2 步驟

將10 mmol/L的七水合硫酸亞鐵水溶液、25 mmol/L的MGD水溶液、蒸餾水及1 mmol/L的SNAP水溶液，按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入電子順磁共振儀的諧振腔中。在測試液反應2 min時上機測試，記錄NO信號第一個峰高度。重復3次作為空白對照樣品，以扣除試劑本身對自由基的影響。然后進行樣品測試，此時用樣品溶液代替蒸餾水。蒸餾水及被測樣品的ESR圖譜見圖6，其中，A為蒸餾水樣品，B為被測樣品。

圖6 蒸餾水樣品和被測樣品ESR圖譜

自由基清除率的計算公式為=[(0–h)/0]× 100%。其中，0為對照樣品中ESR圖譜信號強度測量值，h為樣品中ESR圖譜信號強度測量值。值越大，清除自由基能力越強。

體系中加入待測樣品相比加入蒸餾水的NO加合物自由基信號明顯降低，ESR圖譜對比如圖7、圖8所示。其中，A為體系中加入蒸餾水后的ESR圖譜，B為體系中加入2-(3’-硝基苯)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉后的ESR圖譜，C為體系中加入2-(3’-硝基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉后的ESR圖譜。說明化合物對NO自由基有明顯的清除作用。測定不同濃度的化合物溶液，可計算出化合物清除NO自由基的半數抑制濃度。

圖7 體系中加入待測樣品與加入蒸餾水的ESR圖譜對比之一

圖8 體系中加入待測樣品與加入蒸餾水的ESR圖譜對比之二

4 注意事項及結果討論

由于自由基的不穩定性，每次實驗所需的試劑都要現用現配，對于自由基的產生及捕捉要嚴格控制反應時間及測試時間，以保證實驗的可比性。學生可針對不同濃度的化合物溶液，計算其清除NO自由基的半數抑制濃度。實驗步驟中未明確給出具體化合物濃度，意在要求學生自主進行樣品濃度設定。一般應先從大濃度開始，然后再針對倍比稀釋后的不同濃度的樣品，直至得到活性基本接近空白對照的最小濃度的樣品。最后根據不同樣品濃度的實驗結果計算半數抑制濃度，指導后續實驗。通過該實驗，學生不僅要會做，還要會想，要主動思考問題。實驗操作步驟介紹要有詳有略，既能對學生起到實驗操作指導作用，又要給學生留下充足的思考空間[13]。

5 結語

本文探討了電子順磁共振技術以及電子共振儀的生物分析方法在藥學專業實驗中的應用。通過實驗，學生了解電子順磁共振儀的構造及原理、工作過程及NO自由基的捕捉方法和測定方法。在實驗中，將電子順磁共振技術在科研上的新知識、新理論、新技術和新方法介紹給學生，使他們了解科技前沿動態，增加學習興趣，提高學習熱情。通過使用大型儀器，提高了實驗教學層次，形成了藥學實驗教學特色，學生不僅能夠掌握這項新技術，還可將其運用到自由基清除劑新藥研究工作中。

[1] 邵建群，張楓，何深知，等.藥學專業綜合應用型實驗模式與運行實踐[J]. 西北醫學教育，2013, 21(3): 527–530.

[2] 趙明.專業藥學實驗(Ⅰ)[M]. 北京: 首都醫科大學，2009.

[3] 趙明.專業藥學實驗(Ⅱ)[M]. 北京: 首都醫科大學，2009.

[4] 趙光，閆淑蓮，林婷，等.培養科研型思維藥學人才的探索[J].實驗技術與管理，2014, 31(6): 30–32.

[5] 何深知，崔純瑩，段薇，等.在設計性實驗中培養學生的綜合能力[J].實驗技術與管理，2009, 26(6): 134–136.

[6] 金成樹，遲云超，趙大偉，等.應化專業綜合化學實驗中培養應用型人才的研究[J].廣東化工，2011, 38(3): 185, 188.

[7] 樊媛潔，閆淑蓮，楊華. 在藥學實驗教學改革過程中培養學生的能力[J].首都醫科大學學報（社科版），2007(8): 128–129.

[8] 胡喜蘭，韓照祥，陶瑩，等. DPPH法測定17種植物的抗氧化活性[J].食品科技，2006(10): 264–268.

[9] 陳士明. 電子順磁共振波譜儀[J].上海計量測試，2003(1): 45–47.

[10] 趙保路. 電子自旋共振技術在生物和醫學中的應用[M].合肥：中國科學技術大學出版社，2009.

[11] 周泉生，阮長耿. 一氧化氮及其合成酶異常與疾病[J].生理科學進展，1995.

[12] JUNLING L, MING Zhao, CHAO Wang, et al. Synthesis and bioactivities of nitronyl nitroxide and RGD containing pseudopeptides[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, 13(22): 4065–4069.

[13] 閆淑蓮，唐靜成，何深知，等.藥學專業綜合性實驗的設計與研究[J].中國醫學裝備，2015, 12(6): 21–24.

Application of electron paramagnetic resonance in pharmaceutical experiments

ZHAO Shurui, ZHENG Meiqing, WU Yingting, WANG Yaonan

(Central Laboratory, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

Electron paramagnetic resonance (ESR) is the only direct analytical method for single electron detection, and this method has been applied to the experimental teaching of Pharmacy specialty. Through the experimental teaching of NO free radical scavenging, students are not only directly exposed to modern large-scale electronic paramagnetic resonance instruments and familiar with the generation, capture mechanism and scavenging method of NO free radical, but also train their scientific research thinking, form the characteristics of cultivating pharmaceutical talents and improve their comprehensive experimental skills.

medicinal chemistry experiment; electron paramagnetic resonance instruments; nitric oxide radicals

R91；G642.423

A

1002-4956(2019)10-0201-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.048

2019-01-24

趙淑銳（1983—），女，北京，碩士，主管技師，從事大型儀器管理維護與實驗教學工作。E-mail: zhaoshurui@163.com