氨基酸手性熒光識別及光學組成測定實驗設計

朱園園，王子君，古雙喜，張 珩

氨基酸手性熒光識別及光學組成測定實驗設計

朱園園1，王子君1，古雙喜2，張 珩2

（1. 武漢工程大學 化學與環境工程學院，湖北 武漢 430205； 2. 武漢工程大學 化工與制藥學院，湖北 武漢 430205）

將前沿的科研成果轉化成綜合實驗教學內容，設計了熒光探針對氨基酸手性識別及光學組成測定的綜合性實驗。闡述了熒光探針的手性識別原理、實驗流程、實驗操作及實驗結果分析。該實驗屬于手性化學、光物理、光化學、分析化學交叉學科的前沿研究領域，能激發學生的科研興趣，培養學生的綜合科研能力。該實驗還具有可拓展性，能彌補傳統綜合實驗的重復性和單一性問題。

綜合實驗；熒光探針；手性識別

在當今科技高度發展的時代，化學正從傳統的化學化工領域向能源、生命、材料、信息、醫藥等領域滲透[1]。這就要求化學專業應以培養知識面廣、綜合素質高、有創新能力，且對交叉學科和前沿研究領域具有一定敏感性的高級專業人才為目標。而化學是一門建立在實驗基礎上的學科，教學實驗的合理設計對人才的培養至關重要[2-5]。我校的化學專業綜合實驗是在學生完成4大化學基礎實驗的基礎上開設的，目的是加強學生綜合分析問題和解決問題的能力。本文 提出“熒光探針對氨基酸的手性識別及光學組成的測定”實驗，是具有代表性的綜合實驗設計實例。

1 實驗概述

手性是自然界的基本屬性。作為生命活動基礎的大分子及生命過程中發生的各種生物、化學反應均與手性密切相關。其中手性氨基酸是生命的重要組成部分，并且顯示出重要的生物學功能。目前，手性藥物在上市藥物中的比重越來越大，而手性藥物的不對稱合成中，手性氨基酸常被用作手性前體和手性催化劑配體。因此，氨基酸的手性識別引起了大量關注。

近20年來，熒光探針由于其測定快速、操作簡單并可批量測定的優勢，在有機化合物手性識別中的應用取得很大進展[6-9]。2014年，由Pu和Yu研究組合作在中報道了Zn(II)可以顯著提高基于手性醛的分子熒光探針()-1（見圖1）對手性氨類的對映選擇性識別[10]，后續又有關于不同結構的手性醛類熒光探針在Zn(II)存在條件下對手性氨類（包括氨基酸）的對映選擇性識別的報道[11-13]。

圖1 熒光探針分子結構式

2019年，我們研究組與Pu研究組合作設計的一類熒光探針，將該類型的探針對氨基酸的對映選擇性熒光增強比ef提高到了199[14]。ef=[L–0]/[D–0]=L/D，其中，0為探針分子的熒光強度，L和D分別為與L和D構型的底物反應后的熒光強度。將此課題研究中較為成熟的內容提煉出來，作為化學專業的綜合實驗“熒光探針對氨基酸的手性識別及光學組成測定”。

2 實驗原理

探針分子()-1在氨基酸存在時，其醛基與氨基酸的氨基可以進行縮合反應生成亞胺。由于—C==N—與其鄰位—OH存在氫鍵作用可以形成OH···N==C，從而使其在激發狀態下存在分子內質子轉移，使得熒光淬滅。但當與Zn2+絡合時，這種激發態的分子內質子轉移會被抑制，從而使熒光增強[10]。當()-1與不同構型的氨基酸作用時，由于空間位阻及亞胺產物的分子剛性和穩定性的差別，熒光增強程度不同，從而可以實現對氨基酸的手性識別。另外，若能找到探針熒光強度與氨基酸光學組成之間的關系，便能同時實現對氨基酸光學組成的測定。

3 實驗儀器與藥品

儀器：Horiba FluoroMax-4熒光分光光度計，電子天平，微量移液槍，移液管，4 mL帶刻度離心管。

藥品：熒光探針()-1（99%，自制），D-苯丙氨酸（D-Phe，99%，Macklin），L-苯丙氨酸（L-Phe，99%，Macklin），四丁基氫氧化銨（TBAH·30H2O，98%，Aladdin），無水醋酸鋅（99.99%，Macklin），乙腈（HPLC級），去離子水（自制）。

4 實驗基本流程及實驗方法

本實驗基本流程如圖2所示，包括熒光探針分子和氨基酸母液的配置，探針分子與氨基酸反應液的制備及熒光的測定等。

圖2 實驗流程圖

4.1 母液的配置

4 mg ()-1溶于5.8 mL CH3CN得到2 mM熒光探針母液；256 mg TBAH·30H2O溶于10 mL去離子水得到32 mmol/L的TBAH水溶液；分別稱取5.3 mg D-Phe和L-Phe溶于32 mmol/L的TBAH水溶液得到32 mmol/L的氨基酸母液；5.9 mg Zn(OAc)2溶于5 mL去離子水得到6.4 mmol/L的Zn(OAc)2水溶液。

4.2 反應液的制備

2 mmol/L熒光探針母液用CH3CN稀釋至0.2 mmol/L備用；將32 mmol/L的D-Phe和L-Phe氨基酸母液分別用32 mmol/L的TBAH水溶液稀釋至25.6、19.2、12.8、9.6、6.4、3.2 mmol/L的氨基酸水溶液備用。

接下來進行氨基酸手性識別以及熒光強度與氨基酸當量關系測定的反應液制備。

用移液槍分別移取14份400 μL的()-1熒光探針母液（0.2 mmol/L，1 equiv）于4 mL帶刻度離心管中；再用移液槍分別移取25 μL濃度為3.2、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、32 mmol/L的D-Phe溶液（1、2、3、4、6、8、10 equiv）依次加入7份400 μL的()-1溶液中，同樣用移液槍分別移取25 μL濃度為3.2、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、32 mmol/L的L-Phe溶液（1、2、3、4、6、8、10 equiv）依次加入另外7份400 μL的()-1溶液中；最后用移液槍移取14份25 μL的Zn(OAc)2水溶液（6.4 mM，2 equiv）分別加入以上14份()-1和氨基酸的混合液中。

所有反應液于離心管中密閉靜置2 h后加CH3CN稀釋至4 mL得到熒光待測液，此待測液中()-1的濃度為0.02 mmol/L。同時，濃度為0.02 mmol/L純的()-1探針乙腈溶液，加入了2 equiv Zn(OAc)2的探針溶液，以及同時加入了2 equiv Zn(OAc)2和10 equiv TBAH的探針溶液分別作為熒光識別的對照溶液。

最后進行熒光強度與氨基酸光學純度關系測定的反應液制備。

將濃度為12.8 mmol/L的D-Phe和L-Phe的溶液以不同體積比混合，分別得到總體積為200 μL，L-Phe的光學純度ee值（ee=([L]–[D])/([L]+[D])）分別為–100%、–80%、–60%、–40%、–20%、0、20%、40%、60%、80%、100%的氨基酸溶液備用。用移液槍移取11份400 μL的()-1熒光探針母液（0.2 mmol/L，1 equiv）于4 mL帶刻度離心管中，再用移液槍移取25 μL如上配置的ee值為–100%~100%的11份氨基酸溶液分別加入離心管中，最后用移液槍移取25 μL的Zn(OAc)2水溶液（6.4 mmol/L, 2 equiv）加入這11份混合液中。所有反應液于離心管中密閉靜置2 h后，加CH3CN稀釋至4 mL，得到熒光待測液，此待測液中()-1的濃度為0.02 mmol/L。

5 實驗結果與分析

5.1 激發波長的選擇

為了選擇合適的激發波長，應用熒光儀的3D模式，并設定激發波長和發射波長的掃描范圍分別為317 ~ 417 nm和335~850 nm，對()-1 + 14 equiv L-Phe (in TBAH) + 2 equiv Zn(II)的混合反應液進行了測試，得到如圖3所示的激發波長EX、發射波長EM、熒光強度的關系圖。從圖3可以看到，當激發波長在400~420 nm范圍內時，位于510 nm左右的發射峰強度最強。因此在后面的熒光測試實驗中，選擇了處于該范圍內的417 nm為激發波長。

進行圖3測試的反應液為0.2 mmol/L ()-1（400 μL，in CH3CN，1 equiv）、12.8 mmol/L L-Phe（25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，4 equiv）和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）的混合液；反應液在室溫靜置2 h，并用乙腈稀釋至4 mL后再進行熒光測試；EX= 317 ~ 517 nm，EM= 335 ~ 850 nm，Slit = 2/2 nm。

圖3 激發波長-發射波長-熒光強度關系圖

5.2 探針熒光強度與氨基酸當量的關系及其對氨基酸的手性選擇性

在所選擇的激發波長下，研究了在2 equiv Zn(II)存在條件下，該熒光探針對不同構型的Phe在不同當量下的熒光響應情況，如圖4(a)和4(b)所示。可以看到，未加入氨基酸的sensor、sensor + Zn(II)以及sensor + Zn(II) + TBAH體系均沒有熒光，雖然L和D構型Phe的加入均能打開該探針在＞500 nm的熒光窗口，但是該探針對L-Phe的熒光響應明顯強于對D-Phe的響應。圖4(c)顯示了510 nm處的熒光強度與不同構型的Phe的當量之間的關系，當該探針體系中加入L構型的Phe時，在1 ~ 4 equiv范圍內，熒光強度隨氨基酸當量的增加而顯著增加，在4 equiv L-Phe的條件下達到最大，繼續增加L-Phe的量反而導致熒光強度降低。這說明4 equiv L-Phe與()-1和Zn(II)反應可以達到平衡，繼續增加氨基酸的濃度會導致體系熒光的淬滅。而當該探針體系加入D構型的Phe時，雖然熒光強度與氨基酸當量之間的關系與加入L-Phe的體系類似，但是在整個1~10 equiv范圍內，熒光響應都明顯弱于L構型。因此，()-1可以作為Phe手性識別的熒光探針。圖4(d)顯示了該探針體系對4 equiv D和L構型的Phe的對映選擇性熒光增強結果，計算得到選擇性熒光增強比為3.6。

圖4 熒光探針在不同條件下的熒光響應

圖4(a)為0.2 mmol/L ()-1(400 μL，in CH3CN，1 equiv、3.2~32 mmol/L L-Phe(25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，1~10 equiv)和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液(25 μL，2 equiv)混合液的熒光光譜；圖4(b)為0.2 mmol/L ()-1(400 μL，in CH3CN，1 equiv、3.2~ 32 mmol/L D-Phe(25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，1~10 equiv)和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）混合液的熒光光譜；圖4(c)為熒光探針在510 nm的熒光強度隨D-/L-Phe當量的變化；圖4(d)為熒光探針對4 equiv D-Phe和L-Phe的熒光響應。所有反應液均在室溫密閉靜置2 h后用乙腈稀釋至4 mL，再進行熒光測試；EX= 417 nm，Slit = 2/2 nm。

5.3 測定氨基酸光學組成的標準曲線測定

為了實現該熒光探針在氨基酸光學組成測定中的應用，通過測試得到了熒光強度與氨基酸光學組成之間關系的標準曲線。在4 equiv的Phe的條件下，得到了如圖5所示的關系圖。結果顯示，熒光強度與L-Phe的值呈線性關系，直線方程為= 5 349.62 + 1.10 × 10–6, 確定系數R-Square為0.977 69，其中為510 nm處的熒光強度，為L-Phe的光學純度ee值。該結果說明熒光探針()-1可以用來進行氨基酸光學組成的測定。

圖5 熒光強度與氨基酸光學組成之間關系的標準曲線

熒光探針在510 nm的熒光強度與L-Phe光學純度ee之間的關系測試中，測試液為0.2 mmol/L ()-1（400 μL，in CH3CN，1 equiv）、不同光學純度12.8 mmol/L Phe（25 μL，in 32 mmol/L TBAH水溶液，4 equiv）和6.4 mmol/L Zn(OAc)2水溶液（25 μL，2 equiv）的混合液，在室溫下密閉靜置2 h后用乙腈稀釋至4 mL，再進行熒光測試。EX= 417 nm，Slit = 2/2 nm。

6 結語

該實驗綜合了手性化學、光物理、光化學、分析化學的內容，屬于交叉學科的前沿性綜合實驗，本文從實驗原理、實驗流程、具體操作和實驗結果分析等方面進行了詳細闡述。在實驗結果分析中，按“激發波長選擇—氨基酸手性熒光識別—氨基酸光學組成測定”的思路來進行討論，使學生對熒光探針的研究方法有一個全方位的認識，豐富了學生的研究思路。該實驗還可拓展到對其他氨基酸或其他手性氨類的熒光識別上，可以讓不同學生做不同的手性底物，激發研究興趣，開拓研究思維，彌補傳統實驗的重復性、單一性問題。另外，針對部分綜合能力較強的學生，可以將該實驗拓展至通過核磁和質譜等表征手段對手性識別機理進行研究。

[1] 盧怡，劉金庫.一個應用化學專業綜合實驗的設計及教學實踐[J].化工高等教育，2013, 30(3): 36–39.

[2] 吳音，劉蓉翾，李亮亮.科研成果轉化為綜合性實驗教學探索[J].實驗技術與管理，2016, 33(8): 162–164.

[3] 陳偉，柏正武.超高脫乙酰度殼聚糖制備與表征綜合實驗設計[J].實驗技術與管理，2018, 35(8): 42–45, 50.

[4] 呂占霞, 賀維軍, 高珍, 等.綜合化學實驗教學體系改革與創新[J].大學化學，2011, 26(1): 14–15, 28.

[5] 付穎，葉非.基礎化學系列實驗課程體系優化[J].大學化學，2013, 28(2): 25–28.

[6] PU L. Simultaneous Determination of Concentration and Enantiomeric Composition in Fluorescent Sensing[J]. Accounts of Chemical Research. 2017, 50(4): 1032–1040.

[7] PU L. Enantioselective Fluorescent Sensors: A Tale of BINOL[J]. Accounts of Chemical Research. 2012, 45(2): 150–163.

[8] PU L. Fluorescence of Organic Molecules in Chiral Recognition[J]. Chemical Reviews, 2004, 104(3): 1687–1716.

[9] ACCETTA A, CORRADINI R, MARCHELI R. Enantioselective Sensing by Luminescence[J]. Topics in current chemistry, 2011, 300: 175?216.

[10] HUANG Z, YU S, WEN K, et al. Zn(II) Promoted Dramatic Enhancement in the Enantioselective Fluorescent Recognition of Functional Chiral Amines by a Chiral Aldehyde[J]. Chemical science, 2014, 5(9): 3457–3462.

[11] WANG C, ZENG C, ZHANG X, et al. Enantioselective Fluorescent Recognition of Amino Acids by Amide Formation: An Unusual Concentration Effect[J]. The Journal of Organic Chemistry, 2017, 82(23): 12669–12673.

[12] ZENG C, ZHANG X, PU L. Enantioselective Fluorescent Imaging of Free Amino Acids in Living Cells[J]. Chemistry – A European Journal, 2017, 23(10): 2432–2438.

[13] HERRERA B T, PILICER S L, ANSLYN E V, et al. Optical Analysis of Reaction Yield and Enantiomeric Excess: A New Paradigm Ready for Prime Time[J]. Journal of the American Chemical Society, 2018, 140(33): 10385–10401.

[14] ZHU Y Y, WU X D, GU S X, et al. Free Amino Acid Recognition: A Bisbinaphthyl-Based Fluorescent Probe with High Enantioselectivity[J]. Journal of the American Chemical Society, 2019, 141(1): 175–181.

Design on experiment of chiral fluorescence recognition and optical composition determination of amino acids

ZHU Yuanyuan1, WANG Zijun1, GU Shuangxi2, ZHANG Heng2

(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430205, China; 2. School of Chemical Engineering and Pharmacy, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430205, China)

The frontier scientific research results are transformed into comprehensive experimental teaching contents. A comprehensive experiment of chiral recognition and optical composition determination of amino acids by fluorescent probes is designed. The principle of chiral recognition of fluorescent probes, the experimental process, the experimental operation and the analysis of experimental results are described. This experiment belongs to the frontier research field of chiral chemistry, photophysics, photochemistry and analytical chemistry, which can stimulate students’ interest in scientific research and cultivate their comprehensive scientific research ability. This experiment also has expansibility, which can make up for the repeatability and singularity of traditional comprehensive experiment.

comprehensive experiment; fluorescent probe; chiral recognition

G642.423；O6-339

A

1002-4956(2019)10-0175-04

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.042

2019-02-15

國家自然科學基金項目（201602164）；湖北省教學研究項目（2017335）；武漢工程大學教學研究項目（X2017034）；武漢工程大學科學研究項目（K201716）；武漢工程大學第十二期大學生校長基金（2017061）

朱園園（1982—），女，湖北潛江，博士，副教授，主要從事物理化學的教學和手性化學及熒光探針領域的研究。E-mail:yyzhu531@163.com