成年大鼠心室和竇房結細胞急性分離方法和動作電位比較

范 茁

成年大鼠心室和竇房結細胞急性分離方法和動作電位比較

范 茁

（華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

介紹了急性分離成年大鼠心室肌細胞和竇房結細胞的方法。通過全細胞膜片鉗實驗技術分別檢測了竇房結細胞的自發動作電位和心室肌細胞的誘發動作電位，比較了二者動作電位波形在形態上的差異，并通過計算比較了心室肌細胞和竇房結細胞動作電位時程和靜息電位水平，分析了二者電生理特性差異形成的原因。

心室肌細胞；竇房結細胞；動作電位；動作電位時程；靜息電位

心臟是人及動物重要的供血器官，它靠有規律的博動向周圍器官和組織運輸新鮮血液，供應氧氣和各種養分，使其維持正常的代謝功能[1]。心臟規律性搏動的本質是動作電位的產生和傳導引起的心肌細胞的擴布性舒縮[2-3]。竇房結（sinoatrial node，SAN）位于上腔靜脈和右心房交界處的界溝上端，其作為心臟的起搏點，控制心臟正常的節律性活動，竇房結的起搏細胞（P細胞）產生自發興奮性動作電位，并將沖動傳至新房肌細胞、房室結，進而由房室束傳至心室肌細胞，引起心室收縮[4-6]。在細胞水平研究心臟生理及病理條件下的功能、信號轉導機制及藥物作用機制在基礎研究和臨床應用領域都有很重要的作用。酶解法是獲得成年大鼠心肌細胞的主要方法[7-9]，膜片鉗實驗方法則是研究心肌細胞電生理的主要技術手段[10-12]。

本文介紹成年大鼠心室肌細胞和竇房結細胞的急性酶解分離方法，通過膜片鉗技術手段記錄二者的動作電位波形，并對二者動作電位形態、時程、靜息電位等參數進行分析和比較。

1 溶液配置

（1）臺式液（Tyrode, in mM）：NaCl(120), KCl(5.4), HEPES(25), MgCl2(0.5), NaH2PO4(0.33), Taurine(10), Glucose(20). 室溫調節PH值至7.2。

（2）KB液（in mM）：KOH(80), KCl(40), NaH2PO4(25), MgSO4(3), L-glutanic acid(50), Taurine(20), EGTA(1), HEPES(10), Glucose(10). 室溫調節PH值至7.2。

（3）電生理實驗內液（in mM）：KCl (130), NaCl (10), MgCl2.6H2O(5), HEPES(10), EGTA(0.5), Mg- ATP(5). 室溫調節pH值至7.2。

（4）電生理實驗外液(HBSS, Sigma; in mM): CaCl2(1.3), MgSO4(0.8), KCl(5.4), KH2PO4(0.4), NaCl(136.9), Na2HPO4(0.3), D-glucose(10) and NaHCO3(4.2). 室溫調節pH值至7.2。

2 實驗方法

2.1 成年大鼠心室肌細胞和竇房結細胞的急性分離

2.1.1 成年大鼠心室肌細胞的急性分離

成年SD大鼠（250 g左右，雌雄不限）經腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）、肝素(250 U/kg)后，用75%的酒精消毒胸部皮膚，剪開胸腔并迅速取下心臟，放入預冷無鈣臺式液中，輕輕擠壓出血液，然后將心臟主動脈插于langendorff灌注裝置上，用動脈夾固定位置，并用縫合線扎緊主動脈。按以下步驟對心肌細胞進行酶解分離（灌流液溫度控制在37 ℃）：首先用無鈣臺式液灌流沖洗3~5 min，同時用鑷子輕輕擠壓心臟排出血液，至流出液變澄清；改用充氧的酶I（Tyrode + 0.8 g/L II膠原酶+1.0 g/L牛血清白蛋白+50 μM CaCl2）灌流消化2 min；然后用含蛋白酶的酶II灌流消化（Tyrode + 0.8 g/L II型膠原酶 + 0.1 g/L蛋白酶 + 1.0 g/L牛血清白蛋白，200 μM CaCl2），棄掉前2 min流出液；然后循環灌流消化，待心臟軟塌時剪下心室，并在酶III（Tyrode + 0.8 g/L II型膠原酶 + 1.0 g/L牛血清白蛋白 + 600 μM CaCl2）中剪碎，振蕩消化 3 min，200目金屬網篩過濾后于500 r/min離心1 min，棄上清；然后將細胞懸浮于含1 mmol/L鈣離子的臺式液中（Tyrode + 1.0 g/L牛血清白蛋白 + 1 mmol/L CaCl2），靜置10 min，棄去上清，用M199培養基混勻細胞，置于培養箱備用。

2.1.2 成年大鼠竇房結細胞的急性分離

按分離心室肌細胞同樣的方法，將成年大鼠麻醉、消毒并取出心臟，然后在35 ℃含肝素（10 U/mL）的臺式液中進一步分離出竇房結組織；之后將竇房結組織在含II型膠原酶（0.8 g/L）、蛋白酶（0.1 g/L）和彈性蛋白酶（0.1 g/L）的臺式液中消化分離25~30 min；消化完后將竇房結組織轉入35 ℃ KB液中，用玻璃吸管輕輕吹打分離細胞；梯度復鈣后放入培養箱待用。

2.2 電生理實驗

電生理動作電位記錄采用膜片鉗全細胞記錄模式，信號放大器為HEKA系統EPC-9，采集軟件為PatchMaster，采樣頻率為10 kHz和濾過頻率為2.9 kHz。心室肌細胞動作電位需要由幅度為800 pA、時長為 5 ms的脈沖電流誘發，竇房結細胞則為自發動作電位，無需脈沖電流誘發。動作電位時長用APD50表示，即動作電位幅度復極一半時的時長。

數據分析統計使用的軟件為Origin 8.0，統計方法采用單因素方差分析，統計結果采用Mean + SEM的方式表示。< 0.01表示具有極顯著性差異，用**表示。

3 結果和討論

3.1 心室肌細胞和竇房結細胞形態學觀察

圖1是急性分離的大鼠心室肌細胞和竇房結細胞在倒置顯微鏡下觀察的圖像，左邊為心室肌細胞，右邊為竇房結細胞。由圖1可見，心室肌細胞和竇房結細胞在形態上有明顯差異，心室肌細胞呈長桿狀，輪廓清晰，細胞表面條紋清晰可見；竇房結細胞則呈梭形，兩頭尖細中間較圓，且無明顯橫條紋。

圖1 急性分離的心室肌細胞（Ventricular）和竇房結細胞（SAN）

3.2 心室肌細胞和竇房結細胞動作電位比較

采用膜片鉗電流鉗模式分別記錄了心室肌細胞和竇房結細胞的動作電位，結果見圖2。圖2(a)為心室肌細胞動作電位，由800 pA、5 ms脈沖電流誘發，在動作電位上升初期能看到刺激偽跡（stimulus artifact，SA），圖2(b)為竇房結細胞自發動作電位，為一長串自發動作電位圖形中截取的單個動作電位波形。二者在形態上存在如下差異：

（1）心室肌細胞受電流刺激后，動作電位迅速上升，很短時間達到峰值，而竇房結細胞自發動作電位上升緩慢，二者上升速率分別為（3.99 ± 0.81）V/s和（0.20 ± 0.01）V/s，差異顯著（<0.01）；

（2）復極化過程心室肌細胞有明顯的平臺期，竇房結細胞則沒有明顯平臺期，竇房結細胞復極化過程相對心室肌細胞較快；

（3）心室肌細胞在刺激之前及復極化后能長時間保持靜息化水平，竇房結細胞復極后迅速進入下一個自發動作電位過程（圖2(c)）。

心室肌細胞和竇房結細胞的動作電位時程和靜息電位值比較見圖3。心室肌細胞動作電位時程比竇房結細胞長，二者APD50值分別為（298.91±41.96）ms和（171.75±3.78）ms，有顯著性差異（<0.01）。心室肌細胞靜息電位水平相對竇房結細胞較低，二者分別為（-66.83 ± 2.38）mV和（-51.06 ± 1.31）mV，存在顯著差異（<0.01）。

圖2 心室肌細胞和竇房結細胞動作電位比較

圖3 心室肌細胞和竇房結細胞動作電位時程和靜息電位比較

4 結論

本文檢測表明：心室肌細胞和竇房結細胞在形態上存在明顯差異，心室肌細胞呈現長桿形狀，而竇房結細胞則呈梭形；心室肌細胞表面有明顯橫紋，竇房結細胞表面光滑，無明顯條紋。二者電生理特性也存在顯著差異，表現在竇房結細胞有連續自發動作電位，心室肌細胞動作電位則需要脈沖電流刺激誘發；心室肌細胞動作電位時程較長，且有明顯平臺期，竇房結細胞動作電位時程較短，無明顯平臺期。此外，和竇房結細胞相比，心室肌細胞靜息電位水平較低。心室肌細胞和竇房結細胞分離方法及電生理特性的差異與二者在結構上所處位置、大小、及心臟起搏過程扮演的角色不同有重要關系[13-14]。竇房結是心臟正常節律性活動的起搏點，其節律性活動通過房室結、房室束等組織最后傳至心室，決定了竇房結細胞有自發連續動作電位，電位上升速率較慢，且靜息時間較短等特點。

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Acute isolation of ventricular and sinoatrial node cells and comparison of action potential in adult rats

FAN Zhuo

(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The method of acute isolation of ventricular myocytes and sinoatrial node cells from adult rats is introduced. The spontaneous action potentials of sinoatrial node cells and evoked action potentials of ventricular myocytes are measured by the whole cell patch clamp technique, and the morphological differences of action potentials waveforms between the two methods are compared. The action potential duration and resting potential levels of ventricular myocytes and sinoatrial node cells are calculated and compared, and the reasons for the difference in electrophysiological characteristics between the two cells are analyzed.

ventricular myocytes; sinoatrial node cells; action potential; action potential duration; resting potential

R-332

B

1002-4956(2019)10-0086-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.020

2019-02-21

華南理工大學校級教研教改項目（Y1180661）；華南理工大學探索性實驗項目（Y9180540）

范茁（1979—），女，河北定州，博士，實驗師，研究方向為細胞電生理。E-mail: fanzhuo@scut.edu.cn