免疫組化和直接測序以及焦磷酸測序?qū)DH1突變的比較研究

趙煥英，方 霄，李慎濤，甄亞萍，李 峰，王雷明

免疫組化和直接測序以及焦磷酸測序?qū)DH1突變的比較研究

趙煥英1，方 霄1，李慎濤1，甄亞萍2，李 峰3，王雷明4

（1. 首都醫(yī)科大學(xué) 中心實驗室，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué) 臨檢中心，北京 100069； 3. 首都醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)生物系，北京 100069；4. 首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院，北京 100053）

采用免疫組化法、直接測序法、焦磷酸測序法分別對彌漫性腦膠質(zhì)瘤患者異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）第132位精氨酸的突變進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：3種方法對高頻突變的檢出一致性為90.62%，免疫組化只能檢測出R132H突變類型，而兩種測序方法都能檢測出R132-其他類型的突變；焦磷酸測序檢出靈敏度最高達(dá)3%，直接測序法最經(jīng)濟(jì)和簡便，但靈敏度低，僅能檢測突變率為20%以上的突變。建議先用免疫組化和直接測序初篩IDH1基因突變，對發(fā)現(xiàn)的低頻突變用焦磷酸測序驗證。

異檸檬酸脫氫酶1；免疫組化；直接測序；焦磷酸測序

腦膠質(zhì)瘤是源于神經(jīng)上皮組織的中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前臨床上膠質(zhì)瘤常用診斷標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)組織形態(tài)分成良惡性程度不同的Ⅰ~Ⅳ級[1]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不同類型膠質(zhì)瘤存在不同的分子發(fā)病機制，而根據(jù)組織學(xué)形態(tài)特征分類，相同級別的膠質(zhì)瘤也可具有不同的分子遺傳學(xué)變異背景及生物學(xué)標(biāo)志物[2]。隨著臨床精準(zhǔn)醫(yī)療的開展，腦膠質(zhì)瘤的診斷與治療越來越依賴于臨床分子診斷。如6-氧-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動子甲基化、1p/19q共缺失、編碼組蛋白家族H3.3/H3.1基因突變、異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因突變等[3]。IDH1基因突變最為常見（約占全部IDH1/2基因突變的90%），而且主要是R132H（CGT>CAT）型（占全部IDH1基因突變的90%）[4]。另外還發(fā)現(xiàn)了R132C（CGT>TGT）、R132L（CGT>CTT）、 R132S（CGT>AGT）、R132G（CGT>GGT）等其他少見突變類型[5-6]。IDH基因突變后，酶活性發(fā)生改變，催化α-KG（α-酮戊二酸）生成D-2HG（羥基戊二酸）[7]，大量異常水平的D-2HG積累影響細(xì)胞增殖分化的多條信號通路，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外IDH1突變可導(dǎo)致分化相關(guān)基因高甲基化等[8]。目前臨床上IDH1突變不僅用于腦膠質(zhì)瘤的診斷與鑒別診斷，也用于腦膠質(zhì)瘤的預(yù)測療效和預(yù)后評價，并有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的靶點[9]。針對IDH1突變，臨床常用的檢測方法有免疫組化、直接測序、焦磷酸測序，但每種方法均有其優(yōu)缺點，本文旨在比較三種方法的檢測靈敏性以及實際應(yīng)用效果。

1 實驗材料與儀器

實驗材料：32例形態(tài)學(xué)診斷為腦彌漫性膠質(zhì)瘤（15例彌漫性星形細(xì)胞瘤、10例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和7例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）的石蠟組織包埋標(biāo)本由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院病理科提供。

主要試劑：即用型鼠抗人IDH1R132H 單克隆抗體（克隆號：H09，德國Dianova公司），PV 6000抗鼠二抗（北京中杉金橋生物公司），蛋白酶K（merk），焦磷酸測序試劑（Qiagen 970902），Pyromark PCR kit （Qiagen, 978703）。

儀器：核酸提取試劑盒、Lab-Aid 824核酸提取自動提取儀（廈門至善生物科技有限公司），pGEMT-esay載體（Promega），石蠟切片機（Leica），紫外分光光度計（IMPLEN），PyroMark Q24測序儀、QIAxcel Advanced毛細(xì)管電泳（Qiagen），Quant Studio3D數(shù)字PCR儀、一代測序儀（ABI）等。

2 實驗方法

2.1 石蠟切片準(zhǔn)備

間隔保留10~15張、10 μm厚的膠質(zhì)瘤組織切片粘在玻片上，用于后續(xù)的免疫組化；剩余的切片10~15張，用于后續(xù)的DNA提取。

2.2 免疫組化按照試劑盒操作流程

石蠟標(biāo)本石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理后，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；以IDHl R132H特異一抗（1∶1000）4 ℃過夜，PV6000抗鼠二抗室溫孵育2 h；二氨基聯(lián)苯胺顯色液控制顯色，蘇木精復(fù)染核，鏡下觀察IDH1R132H的表達(dá)情況。IDH1為胞漿蛋白，在胞漿及胞核部位著色為黃色、棕黃色或者褐色顆粒為陽性，并且明顯高于背景為陽性細(xì)胞，觀察切片中5個高倍視野（×200），陽性病例又可根據(jù)染色強度分為強陽性和陽性和弱陽性。

2.3 測序法

（1）設(shè)計合成IDH1 132 位點上下游引物。上游：5?-accaaatggcaccatacga-3?，下游：5?-tgacttacttgatcccc-ataagc-3，一代測序上機引物為上游引物；焦磷酸測序用下游引物5?端標(biāo)記生物素，上機測序引物為taaaccctatcatcata，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（2）DNA提取。石蠟標(biāo)本二甲苯脫蠟后，蛋白酶K 55 ℃消化2 h，然后90 ℃、15 min滅活蛋白酶，離心后將上清加入至善生物核酸自動提取試劑條中第一孔，裝入核酸自動提取儀中提取DNA。提取后用紫外分光廣度計檢測濃度和質(zhì)量。

（3）PCR擴(kuò)增IDHl片段。IDHl上游、下游引物擴(kuò)增待測序片段。分別擴(kuò)增直接測序和焦磷酸測序的IDH1片段產(chǎn)物，其中用于焦磷酸測序下游引物帶生物素標(biāo)記。擴(kuò)增體系為Pyromark PCR kit中2×Master Mix 25 μL，10 pmoL/L上、下游引物各1 μL，DNA模板100 ng，補水至50 μL。PCR程序：95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min，1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測目的條帶。一代測序利用測序試劑盒中bigdye mix，上游引物為測序引物，于ABI公司3700型測序儀進(jìn)行測序。焦磷酸測序：首先將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與連接鏈霉親和素的小珠子進(jìn)行振蕩孵育20 min，后對雙鏈DNA進(jìn)行變性和清洗掉沒有生物素標(biāo)記的正義鏈，獲取結(jié)合在小珠子上的反鏈DNA序列，80 ℃加熱2 min，使單鏈DNA從小珠子上解離下來，并進(jìn)而與測序引物結(jié)合。在PyroMark Q24測序儀上對引物結(jié)合單鏈DNA進(jìn)行焦磷酸測序及結(jié)果收集。通過PyroMark Q24軟件對序列進(jìn)行分析。

（4）IDH1 R132H 測序標(biāo)品的構(gòu)建。構(gòu)建IDH1 R132H 突變質(zhì)粒和野生質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證有高突變的PCR IDH1片段；進(jìn)行凝膠電泳、膠回收，回收PCR片段與PGEMT-easy載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細(xì)胞，鋪板，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取白色克隆在氨芐瓊脂培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通用引物SP6一代測序，直到測出R132H突變型質(zhì)粒；然后陽性目標(biāo)菌液再放大培養(yǎng)重新大量提取質(zhì)粒，經(jīng)數(shù)字PCR及Qubit核酸定量儀對標(biāo)品進(jìn)行絕對定量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

判讀免疫組化陽性結(jié)果，分析腦膠質(zhì)瘤各蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計測序方法突變情況。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，測序方法突變檢出陽性率的比較采用χ2檢驗。以<0.05為差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 免疫組化學(xué)結(jié)果

32例腦彌漫性膠質(zhì)瘤患者中，17例IDHl R132H免疫組化結(jié)果為陰性；其余15例IDHl R132H免疫組織化陽性，4例為強陽性，6例為陽性，3例為弱陽性，見圖1。

A-強陽性；B-陽性；C-弱陽性；D-陰性。

3.2 焦磷酸測序與直接測序結(jié)果

利用含生物素標(biāo)記的IDH1引物樣本DNA經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測條帶單一且大小為141 bp，繼而進(jìn)行生物素單鏈的獲取，于PyroMark Q24測序儀上利用測序引物引導(dǎo)序列測定。圖2為焦磷酸測序結(jié)果，圖2中 E—H對應(yīng)圖1的A—D。圖2中E顯示CAT占86%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CGT 14%，跟圖1A顯示強陽性結(jié)果一致，圖2中F對應(yīng)圖1B中陽性結(jié)果，CAT占55%，圖2中G對應(yīng)圖1中C陽性，CAT占21%，圖2中H中CAT檢測1%，對應(yīng)圖1中D陰性免疫組化，一般商用的PyroMark檢測試劑盒，其靈敏度都建議設(shè)在5%~10%之間，如MGMT[10]，不同的研究者針對IDH1 132位點建立焦磷酸測序方法也有很多，報道的靈敏度一般不超過5%[11-12]，有研究者檢測靈敏度，甚至達(dá)到2%[13]。本方法建立中，構(gòu)建IDH1野生和突變質(zhì)粒，經(jīng)過數(shù)字PCR絕對定量后，按比例兩者混合，檢測到突變靈敏度為3%。這可能與擴(kuò)增產(chǎn)物的長度不同、標(biāo)記的生物素位置不同、擴(kuò)增產(chǎn)物的純度不同、及測序引物不同導(dǎo)致的檢測靈敏度會有差異。

圖3為直接測序結(jié)果。

圖2 焦磷酸測序結(jié)果

圖3 直接測序結(jié)果

3.3 利用IDH1非生物素引物擴(kuò)增后

電泳檢測單一目的條帶121 bp，進(jìn)行 sanger一代直接測序，4個樣品對應(yīng)的一代測序結(jié)果見圖3。圖3中I和J明顯看出有套峰，綠色峰是A堿基，藍(lán)色峰是G堿基，這與圖2的E、F測出的A堿基與G堿基比率結(jié)果類似，而圖3K中A套峰很低，單從一代測序判斷是否有突變不好判斷，而圖2G給出的A堿基突變率是21%，這與一代測序檢測靈敏度低，對低于20%的突變易造成漏檢，從而易產(chǎn)生誤診[14]。

3.4 3種方法

對32例樣本檢測結(jié)果比較見表1，其中17個未突變樣本及12個陽性或強陽性R132H突變樣本3種方法都能檢測出，3個結(jié)果的一致性為90.62%；但免疫組化受限于抗體種類，只能檢測R132H突變類型，僅檢測CGT→CAT之間的突變，其他的突變類型不能檢測，本組樣本中有一例為CGT→AGT突變類型未測到。另外，免疫組化弱陽性的結(jié)果受限于檢測者熟練程度及主觀性的特點[5]，比Pyromark 焦磷酸測序少檢出一種。直接測序是目前應(yīng)用最廣的檢測方法，需要靠有無套峰來判斷，受測序基線干擾，經(jīng)統(tǒng)計只有超20%以上的突變才能判斷出是否由突變引起的套峰，這與其他作者的報道類似。對3種方法綜合比較見表2。

表1 3種方法檢測IDH1R132H突變結(jié)果

表2 3種方法檢測IDH1突變優(yōu)缺點

4 結(jié)語

目前臨床上普遍開展的IDH1 突變檢測是利用商業(yè)化的IDH1R132H 單克隆抗體進(jìn)行免疫組化檢測，但檢測只限CGT→CAT突變類型。科研中直接測序因價格低廉和操作簡便備受青睞，但對低頻突變因檢測靈敏度低會漏檢。焦磷酸測序因其高靈敏度近幾年不斷在突變檢測中被開發(fā)利用，尤其對低頻突變它更有優(yōu)勢。因此建議先用直接測序或免疫組化進(jìn)行初步檢測，對弱陽性樣本用焦磷酸測序驗證。

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Comparative study of IDH1 mutation by immunohistochemistry, direct sequencing and pyrophosphatic acid sequencing

ZHAO Huanying1, FANG Xiao1, LI Shentao1, ZHEN Yaping2, Li Feng3, WANG Leiming4

(1. Central Laboratory, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2.Clinical Inspection Center, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3.Neurobiology Department, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 4. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China)

Mutations in 132 arginine of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) in diffuse glioma patients are detected by immunohistochemistry, direct sequencing and pyrophosphate sequencing respectively. The results show that the consistency of the three methods is 90.62%. Immunohistochemistry can only detect the mutation type of R132H, and both sequencing methods can detect the mutation of R132-other types. The sensitivity of pyrophosphate sequencing is up to 3%. Direct sequencing is the most economical and simple method, but its sensitivity is low, which can only detect mutations with mutation rate of more than 20%. It is suggested that IDH1 gene mutation should be screened by immunohistochemistry and direct sequencing, and low frequency mutation should be verified by pyrophosphate sequencing.

IDH1; immunohistochemistry; direct sequencing; pyrophosphate sequencing

Q754

A

1002-4956(2019)10-0073-04

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.017

2019-02-26

趙煥英（1975—），女，河北邯鄲，碩士，副主任技師，研究方向為分子測序。E-mail: zhaohy75@sina.com