活性氧對白腐真菌漆酶合成的影響

田喬鵬， 汪新悅， 張 永， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

植物病原菌在自然界中廣泛存在，包括真菌、細菌、病毒等，其中真菌是主要的植物病原菌[1]。病原菌在植物從種子到成樹的各個階段都會對植物進行侵染，對植物壽命和繁殖產生嚴重影響[1]。白腐真菌就是這樣一類重要的病原菌，能降解活體樹木及木材中的木質素，使木質腐變成白色。白腐菌能夠高效分泌多種胞外氧化酶類，包括漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）和木質素過氧化物酶（LiP）等，這些酶參與木質纖維素基質木質素的降解[2]。漆酶（EC 1.10.3.2）屬于氧化還原酶類，催化底物氧化同時將分子氧還原成水[3]。金屬離子[4-5]，木質素和芳香族化合物[6]，氮源[7]和碳源[8-9]通常可以誘導漆酶基因的表達。

漆酶參與病原微生物對植物的侵染，是植物病害發生的重要過程。研究其合成的調控，尤其是活性氧對其表達的調控，有利于探明植物與病原微生物相互作用的分子機理，構建植物病害的無公害防控技術模型，為解決農藥污染問題提供新的思路。

活性氧（AOS）主要包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，在植物-病原菌相互作用的過程中，具有重要的意義[10-11]。活性氧是正常細胞代謝或由于接觸到一些壓力因素產生的一種副產物，比如溫度的變化、金屬離子或氧化還原循環的存在[12]。真菌和其他真核細胞一樣，都進化出了具有防御過量的活性氧的解毒物質，包括酶和一些低相對分子質量的化合物。當氧化劑的量增加到超出了細胞的抗氧化能力時，可以觀察到氧化應激（oxidative stress）現象[12]。早期的植物-病原真菌研究表明，漆酶參與對抗氧化應激。畢赤酵母中表達白腐真菌漆酶基因可以顯著增強酵母細胞抵抗H2O2介導的氧化脅迫的能力，通過誘導激活酵母谷胱甘肽抗氧化系統（包括谷胱甘肽，谷胱甘肽過氧化物酶，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，谷胱甘肽還原酶）[13]，說明白腐真菌漆酶也參與了對抗氧化應激。

近年來，植物-病原菌相互作用研究發現，病原菌本身存在釋放活性氧的現象[14-15]。活性氧的釋放很可能與植物病原菌的致病性具有一定的聯系[16-17]。氧化破裂、瞬態和活性氧（ROS）的快速積累，是高等植物對病原菌攻擊的廣泛防御機制[16]。病原菌與植物相互作用涉及活性氧的產生與清除，微生物也可能通過產生抗氧化酶和木質纖維降解酶類，通過降低局部的氧和活性氧，防御自己免受活性氧傷害和降解植物細胞壁，并最終入侵成功[18]。

已有不少研究證實，活性氧參與細胞信號傳導，盡管其在高濃度下具有損傷有機大分子進而破壞細胞結構的作用，其也能在一定濃度范圍內介導相關信號傳導，調節細胞做出應答反應[19]。所以研究活性氧對白腐真菌漆酶合成的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產漆酶菌株Pycnoporussp.SYBC-L3（L3）：作者所在實驗室篩選到的高產菌株，保藏于江南大學工業生物技術重點實驗室內。PDA固體斜面保藏于4℃冰箱中，每月活化一次。

1.1.2 試劑 葡萄糖、麥芽糖、酵母膏、蛋白胨、酒石 酸 銨 、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、MnSO4·4H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H4O、 愈 創 木 酚（DMP）、吐溫-80、一水檸檬酸：均為國產分析純試劑。豆粕：市售產品。

1.1.3 儀器與設備 YXQ-LS-50立式蒸氣壓力滅菌鍋：上海博迅公司產品；組合式搖床：太倉市強樂實驗設備有限公司產品；LRH-250培養箱：廣東省醫療器械廠產品；UV-6000紫外可見分光光度計：METASH；恒溫水浴鍋：常州中誠儀器制造有限公司產品；CP313電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司產品；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司產品；蛋白電泳儀：生工生物工程（上海）股份有限公司產品；凝膠成像儀：生工生物工程（上海）股份有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基與培養條件

1）種子培養 培養基（g/L）：葡萄糖（50），酵母膏（10），蛋白胨（5）。 115 ℃滅菌 20 min。

培養條件：從活化后（7 d）的平板上用10 mL無菌水將孢子沖洗下來，在裝有玻璃珠的錐形瓶中搖勻（錐形瓶裝玻璃珠一起滅菌后使用），取1 mL接種至種子培養基，接種量為體積分數2%，200 r/min、30℃的條件下培養2 d。

2）發酵培養 優化培養基[20]（g/L）：麥芽糖（12），豆粕（6），CuSO4·5H2O（0.5），MnSO4·H2O（0.034），KH2PO4（1），Na2HPO4·12H2O（0.2），MgSO4·7H2O（0.5），吐溫-80（0.5），DMP 0.8 mmol/L。115℃滅菌20min。

基礎培養基[21]（g/L）：葡萄糖（10），酒石酸銨（2），KH2PO4（1），Na2HPO4·12H2O（0.2），MgSO4·7H2O（0.5），CuSO4·5H2O（0.01），MnSO4·4H2O（0.01）。115℃滅菌20 min。

最佳培養條件[20]：起始pH值4.0、種齡2 d、接種量10%、轉速200 r/min。

1.2.2 漆酶酶活的測定 粗酶液的制備：發酵液8800g離心10 min得到的上清液即為粗酶液，冰箱4℃保存備用。以DMP為底物測定漆酶酶活，參照Wang等[22]的測定方法略做調整。

1.2.3 生物量的測定 培養一定時間后取出搖瓶，8800g離心10 min，收集菌體，上清液用于測定漆酶酶活，菌體在60℃烘箱中烘干至恒重，稱量獲得菌體的干重（以g/L表示）[23]。

1.2.4 活性電泳分析 參考曾等[24]的方法進行。

1.3 實驗設計

1.3.1 菌株胞外漆酶產酶曲線的測量 以發酵優化培養基，在最佳產酶條件下對L3進行搖瓶發酵，每24 h取一次樣，測漆酶酶活，確定L3胞外的產酶曲線和產酶高峰期，為下一步研究活性氧對白腐菌產漆酶的影響確定處理時間。

1.3.2 超氧陰離子對白腐菌產漆酶的影響 以發酵優化培養基，在最佳產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在產酶高峰期前期第4天分別向錐形瓶中加入過濾除菌的體積分數10%AP溶液，隨后分別加入過濾除菌的TEMED并迅速搖勻 （AP溶液與TEMED 溶液的體積比為 10∶1）， 總體積為 40、80、120、160 μL，對照組加 160 μL 的無菌水。 第 8 天取樣，測漆酶酶活和生物量。

1.3.3 過氧化氫對白腐菌產漆酶的影響

1）低濃度過氧化氫對白腐菌漆酶合成的影響以發酵優化培養基，在最佳產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在產酶高峰期前期第4天分別向錐形瓶中加入無菌水稀釋的過氧化氫溶液處理真菌細胞，終濃度為 3、6、9、12、15 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。第8天取樣，測漆酶酶活，生物量。

確定最佳濃度為12 mmol/L后，以發酵優化培養基，在最佳產酶條件下再一次對L3進行搖瓶發酵培養，在產酶高峰期前期第4天分別向錐形瓶中加入無菌水稀釋的過氧化氫溶液處理真菌細胞，終濃度均為12 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。定時取樣，測漆酶酶活，考察添加12 mmol/L H2O2之后漆酶分泌隨時間變化情況。

以發酵基礎培養基，在上述產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在第4天分別向錐形瓶中加入無菌水稀釋的過氧化氫溶液處理真菌細胞，終濃度為12 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。24 h后取樣，對樣品進行活性電泳分析。

2）高濃度過氧化氫對白腐菌漆酶合成的影響以發酵基礎培養基，在上述產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在第4天分別向錐形瓶中加入無菌水稀釋的過氧化氫溶液處理真菌細胞，終濃度為50、100、200 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。24 h后取樣，測漆酶酶活，生物量。

1.3.4 鐵離子對白腐菌產漆酶的影響 以發酵優化培養基，在最佳產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在產酶高峰期前期第4天分別向錐形瓶中加入過濾除菌的硫酸亞鐵溶液處理真菌細胞，鐵離子終濃度為 1、3、5、15、30、60 mmol/L， 對照組加等體積的無菌水。為了突出鐵離子對白腐菌產漆酶的影響，選擇第8天取樣，測漆酶酶活，生物量。

1.3.5 羥自由基對白腐菌產漆酶的影響 控制Fe2+濃度為1 mmol/L，H2O2濃度為1 mmol/L，初步考察羥自由基對白腐菌產漆酶的影響。以發酵基礎培養基，在上述產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在第4天向實驗組中加入過濾除菌的 Fe2+-EDTA溶液和無菌水稀釋的H2O2溶液，終濃度均為1 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。24 h后取樣，測漆酶酶活和生物量。

在前期的基礎上降低羥自由基的添加量，參考Belinky等[25]方法處理真菌細胞，控制Fe2+濃度為0.1 mmol/L，H2O2濃度為 0.5 mmol/L，并設置兩組消極對照組，考察羥自由基對白腐菌產漆酶的影響。以發酵基礎培養基，在上述產酶條件下對L3進行搖瓶發酵培養，在第4天向實驗組（Fenton組）中加入過濾除菌的Fe2+-EDTA溶液和無菌水稀釋的H2O2溶液，終濃度分別為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L，加入后迅速搖勻。消極對照組先加入終濃度為50 mmol/L過濾除菌的二甲基亞砜（DMSO）或甘露醇（Mannitol）溶液（兩種溶液的濃度一樣），隨后加入過濾除菌的Fe2+-EDTA溶液和無菌水稀釋的H2O2溶液，終濃度同實驗組，迅速搖勻。對照組加入與實驗組等體積的無菌水。24 h后取樣，測漆酶酶活和生物量，對樣品進行活性電泳分析。

1.3.6 數據分析 每個實驗設置3個平行，采用Origin8.5軟件進行數據分析與繪圖。

2 結果與討論

2.1 菌株胞外漆酶產酶曲線

由圖1可知，第8天胞外漆酶酶活達到最大值，前3天主要為適應期和前期菌體的生長，第4天到第8天為產酶高峰期，作者選擇產酶高峰期前期第4天為后續實驗的處理時間，研究外界活性氧對白腐菌產漆酶的影響。

圖1 優化培養基中Pycnoporus sp.SYBC-L3胞外漆酶產酶曲線Fig.1 Production of laccase by Pycnoporus sp.SYBC-L3 in the optimal medium

2.2 超氧陰離子對白腐菌產漆酶的影響

AP-TEMED混合溶液可以產生超氧陰離子，產生多少與體積成正相關。實驗結果如圖2所示。超氧陰離子對白腐菌產酶起抑制作用，酶活隨著添加量的增加而逐漸降低（y=-0.17472x+98.89778，R2=0.91076），當添加量為160 μL時酶活為對照組69%；生物量隨著添加量的增加而略有增加 （y=0.0054x+9.40761，R2=0.79842）。

圖2 超氧陰離子對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響Fig.2 Effect of Oon laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3

2.3 過氧化氫對白腐菌產漆酶的影響

2.3.1 低濃度過氧化氫對白腐菌漆酶合成的影響實驗結果如圖3所示，在0～12 mmol/L范圍內，H2O2對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶具有促進作用。酶活隨著添加量的增加而逐漸增加，生物量也隨著添加量的增加而略有增加。原因可能是H2O2參與了細胞間的信號傳導過程，誘導了特定基因的表達，從而促進漆酶的合成。cGMP是細胞中一種重要的第二信使，由細胞內鳥苷環化酶催化合成，H2O2對鳥苷環化酶活性具有激活作用，O2-對鳥苷環化酶活性具有抑制作用[26-27]。這也解釋了為什么超氧陰離子加入量越多，Pycnoporussp.SYBC-L3漆酶合成越少。H2O2濃度過高，對漆酶合成反而又有抑制作用。實驗結果顯示H2O2濃度高于15 mmol/L時，漆酶合成下降，在15 mmol/L時相對酶活僅為106%。原因是濃度過高，會殺傷或者殺死一定的細胞，對漆酶的分泌不利。

圖3 低濃度H2O2對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響Fig.3 Effect of low concentration H2O2on laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3

由于12 mmol/L H2O2對Pycnoporussp.SYBCL3產漆酶促進作用顯著，接著考察添加12 mmol/L H2O2之后漆酶分泌隨時間變化情況，結果如圖4所示。在加入H2O2之后的12 h內，實驗組產酶量明顯比對照組低，相比較處理前，酶活基本上沒有增加，甚至下降。實驗結果說明即使是低濃度的H2O2對Pycnoporussp.SYBC-L3細胞仍然有一定的毒害作用，即H2O2會殺傷或者殺死一定量的正常細胞。但是，在12 h之后，實驗組漆酶活力反而超過了對照組，在96 h時酶活達到對照組127%，明顯高于對照組，說明在12 h之前實驗組漆酶相關基因就迅速表達了，事實上這些基因的表達水平還要高于這個測量值。后期實驗選擇24 h為取樣時間。

圖4 添加12 mmol/L H2O2后Pycnoporus sp.SYBC-L3胞外漆酶產酶曲線Fig.4 Profile of laccase production by Pycnoporus sp.SYBC-L3after added 12 mmol/L H2O2to the medium

優化培養基中Pycnoporussp.SYBC-L3會同時分泌3種同工酶，第5天到第8天發酵上清液電泳結果能看到兩條清晰的條帶（lac1，lac2）[28]。 而實驗過程中發現，電泳結果顯示對照組與實驗組均出現一條帶和兩條帶，第二條帶（lac1）差異并不明顯，說明lac1所對應的漆酶基因表達可能不受活性氧直接影響，后期實驗改用基礎培養基研究活性氧對白腐菌產漆酶的影響。為了使結果更加明顯，粗酶液稀釋10倍，電泳結果如圖5所示，經底物DMP染色后只有一條帶，對應漆酶lac2，實驗組顏色明顯比對照組要深，說明酶活比對照組高，與測量值相符，進一步證明過氧化氫促進漆酶的表達。

圖5 12 mmol/L H2O2對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響（非變性電泳圖）Fig.5 Effect of 12 mmol/L H2O2on laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3（Native PAGE stained with DMP）

2.3.2 高濃度過氧化氫對白腐菌漆酶合成的影響為突出高濃度H2O2對細胞的毒害作用，選擇發酵基礎培養基，加入更高濃度的H2O2進行實驗，結果如圖6所示。隨著H2O2濃度的增加，發酵液胞外漆酶酶活越來越低，當H2O2濃度為200 mmol/L時，漆酶活力只有對照組的16%左右，說明此時大量細胞已被H2O2殺死。生物量隨著H2O2濃度的增加略有增加。

圖6 高濃度H2O2對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響Fig.6 Effect of high concentration H2O2on laccaseproduction in Pycnoporus sp.SYBC-L3

2.4 鐵離子對白腐菌產漆酶的影響

鐵離子對真菌產漆酶通常具有抑制作用[29-30]，為下一步研究羥自由基對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶的影響找到適當的鐵離子濃度范圍，首先研究了不同濃度Fe2+對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶和生物量的影響，結果如圖7所示。高濃度的Fe2+對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶具有嚴重抑制作用，當Fe2+濃度為15 mmol/L時，相對酶活為對照組1.08%；低濃度的Fe2+對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶雖有抑制作用，但不是很明顯，當Fe2+濃度為1 mmol/L時，相對酶活為對照組99.0%。后期研究均控制Fe2+濃度在1 mmol/L以下。生物量隨著Fe2+濃度的增加而迅速增加。

2.5 羥自由基對白腐菌產漆酶的影響

高濃度的羥自由基存在時可以直接殺死病原菌[31]，當羥自由基濃度較低時是否會促進白腐菌漆酶合成，目前還不是很清楚，設計實驗研究了低濃度的羥自由基對白腐菌產漆酶的影響。

羥自由基（·OH）的產生一般是通過Fenton試劑生成，這是一種經典的產生羥自由基方法，它采用H2O2為氧化劑，Fe2+為催化體系的氧化反應[32]。

圖7 Fe2+對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響Fig.7 Effect of Fe2+on laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3

控制 Fe2+濃 度為 1 mmol/L，H2O2濃度為 1 mmol/L，初步考察羥自由基對白腐菌產漆酶的影響，結果如圖 8（a）、（b）所示。 低濃度的羥自由基對Pycnoporussp.SYBC-L3產漆酶具有促進作用，效果比單純的添加過氧化氫（H2O2）更明顯。實驗組酶活為對照組的156%，生物量只有對照組的119%。

在前期的基礎上降低羥自由基的添加量，控制Fe2+濃度為 0.1 mmol/L，H2O2濃度為 0.5 mmol/L，并設置兩組消極對照組，考察羥自由基對白腐菌產漆酶的影響，結果如圖 8（c）、（d）所示。 實驗組酶活為對照組的145%，生物量為對照組的124%。消極對照組酶活也略有提高，生物量大體和實驗組差不多，均高于對照組，說明低濃度的羥自由基確實能促進白腐菌漆酶的合成。

圖 8 羥自由基（·OH）對Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響Fig.8 Effect of hydroxyl radical （·OH） on laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3

電泳結果如圖9所示，經底物DMP染色后只有一條帶，對應漆酶lac2，實驗組顏色均比對照組深，說明酶活比對照組高，與測量值相符，進一步證明低濃度的羥自由基促進漆酶的表達。

圖9 羥自由基（·OH）對 Pycnoporus sp.SYBC-L3產漆酶的影響（非變性電泳圖）Fig.9 Effect of hydroxyl radical （·OH） on laccase production in Pycnoporus sp.SYBC-L3（Native PAGE stained with DMP）

在超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）3種活性氧中，超氧陰離子毒性較強，對白腐菌產漆酶起抑制作用；過氧化氫毒性較小，容易擴散，可以和過渡金屬Fe2+、Cu+發生Fenton反應，產生毒性最大的羥自由基，低濃度的過氧化氫和低濃度的羥自由基對白腐菌產漆酶均起到促進作用。

實驗結果說明高濃度的活性氧不利于病原菌生長，低濃度的活性氧（主要指H2O2和·OH）不但抑制不了病原菌生長，反而促進病原菌入侵，這可能就是植物-病原菌相互作用進化的結果。病原菌入侵植物的過程中，植物想通過產生活性氧抑制病原菌生長，這個過程是需要氧氣的，而漆酶可以消耗氧氣，從而使微環境中的氧含量減少，同時漆酶可以增強白腐菌細胞的抗氧化能力，保護了白腐菌免受宿主防御傷害，有利于病原菌入侵。當產生的活性氧濃度較低時，漆酶表達增強，反而有利于白腐菌侵染植物；當產生的活性氧濃度較高時，漆酶表達低，白腐菌侵染能力也就受到了限制，這或許就是為什么植物會在病原菌入侵時大量積累活性氧的原因。不同的病原菌漆酶表達能力不同，所能耐受的活性氧濃度也不同，也就決定了病原菌能否入侵成功。

3 結 語

通過研究3種不同的活性氧對白腐菌產漆酶的影響，發現超氧陰離子抑制白腐菌產漆酶，低濃度的過氧化氫和低濃度的羥自由基促進白腐菌產漆酶。找到了受ROS調控的漆酶（lac2）。實驗過程中發現不同的培養條件漆酶活力不同，漆酶酶活越高，菌體抗過氧化氫氧化脅迫能力越強，說明漆酶是菌體受到一定的氧化脅迫作用時表達的。實驗結果對于理解植物-病原菌相互作用具有重要意義，也為漆酶表達調控提供一些借鑒。