微波法高效制備固定化胰蛋白酶

劉偉華， 姜子濤， 李 榮

（天津商業大學 生物技術與食品科學學院/天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

胰蛋白酶是一種肽鏈內切酶，能水解由賴氨酸和精氨酸的羧基參與形成的肽鏈，被廣泛地應用于輕工業及醫療行業。然而游離的胰蛋白酶穩定性較差，因此對游離的胰蛋白酶進行修飾，如采用固定化等方法來延長其使用壽命是十分必要的。

樹脂是一類多聚物，具有一定的孔徑和-COOH、-OH、≡N等功能基團，結構穩定，機械性能良好，可以作為固定化酶的載體[1-12]。

微波能使極性分子發生自旋運動而被加熱，微波能提高反應的效率及產率。如微波提取[13]、微波合成[14]、微波酶解[15]、微波輔助固定化微生物[16]，微波固定化肝素[17]以及微波固定化酶[18-25]等。值得一提的是，采用微波輔助制備的固定化酶穩定性較好，甚至酶活力也有所提高?？梢?，采用微波來制備固定化酶是可行的。

因此，通過從9種樹脂中篩選出效果較好的D151樹脂作為固定化胰蛋白酶的載體，采用吸附-微波輔助交聯法，制備固定化胰蛋白酶。選用中心組合設計設計-響應面法（CCD-RSM）優化制備固定化胰蛋白酶的工藝，并對固定化胰蛋白酶的性質及應用做了相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶：上海阿拉丁生物科技股份有限公司產品；戊二醛和乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司產品； 樹脂（D3520、D4020、H103、NKA-9、D301R、D380、D280、D061、D151）： 天津南開合成科技有限公司產品；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Multi SYNTH微波合成儀：意大利Milestone公司產品；Alpha-1500紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司產品；WE-1水浴恒溫振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司產品；1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品；色譜柱Vydac-C18（250 mm×4.6 m，5 μm）：Grace公司產品；DK-S12 電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 微波輔助固定化胰蛋白酶 準確稱取0.5 g樹脂，加入用緩沖溶液配制的胰蛋白酶溶液5 mL，在水浴恒溫振蕩器中吸附一定時間，然后加入一定濃度的戊二醛置于微波合成儀中，微波輔助交聯胰蛋白酶。交聯完成后用蒸餾水將殘留的戊二醛清洗干凈。

1.3.2 酶活力的測定 采用福林酚法[18]。在40℃、pH 8.0的條件下，1 min內水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，以U表示。

1.3.3 單因素實驗 準確稱取0.5 g樹脂，分別改變吸附時間、戊二醛質量分數、加酶量、pH、交聯時間及交聯溫度等因素，制備固定化酶，并測定制備的固定化酶的活力。

1.3.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，通過方差分析選取主要的影響因素并選用CCDRSM設計實驗方案，響應面的因素編碼及變量水平如表1所示。

表1 響應面因素編碼及水平Table1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 固定化胰蛋白酶性質的研究

1）溫度穩定性 將固定化胰蛋白酶分別在25、35、45、55、65℃不同溫度的水浴中放置3 h后測定其酶活力。

2）酸堿穩定性 將固定化胰蛋白酶分別置于pH為4～10的緩沖液中在室溫下放置3 h后測定固定化酶的活力。

3）重復使用性 按照1.3.2的方法，重復使用固定化胰蛋白酶，同時測定酶活力。每使用完一次將固定化酶分別用蒸餾水和緩沖液清洗干凈，并將其置于新的底物中繼續反應。

4）儲藏穩定性 將固定化胰蛋白酶置于4℃冰箱密封保存，每一周測定固定化酶的活力。

1.3.6 固定化胰蛋白酶的應用 為了進一步比較固定化胰蛋白酶與游離胰蛋白酶在應用方面的差異，在50℃、固定化胰蛋白酶及游離胰蛋白酶各自適宜的pH條件下，水解底物質量分數為4%的酪蛋白溶液，然后將水解液分別冷凍干燥。之后用HPLC對水解產物進行分析。色譜條件為流動相：超純水（A），乙腈（B）；洗脫條件：0～5 min，體積分數 3%B；5～10 min， 體積分數 6%B；10～15 min， 體積分數10%B；15～25 min，體積分數 40%B。 流量：1 mL/min，進樣量：20 μL，檢測波長：275 nm。

1.3.7 水解度的測定 選用pH-State法，測定酪蛋白水解產物的水解度（DH），其公式為

式中，B為堿液體積 （mL）；Nb為堿液的摩爾濃度（mol/L）；α 為 α-氨基的離解常數；Mp為酷蛋白的質量（mg）；Htot為每克酪蛋白中肽鍵的毫摩爾數（mmol/g）。

2 結果與分析

2.1 樹脂載體的選擇

向各樹脂中加入等量的酶溶液，在恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h。通過測定上清液中的酶濃度計算吸附的酶量，并測定固定化酶的活力，不同樹脂載體的固定化效果見表2。

表2 不同樹脂載體的固定化效果Table2 Immobilization results of different resins

由表可知，就吸附酶量來看，弱極性的大孔陰離子（D380）、大孔陽離子（D151）和大孔吸附樹脂NKA-9效果較好。就單位固定化酶活性來看，D151的活性最高，而固定化吸附酶量較高的大孔吸附樹脂（NKA-9）和弱極性的大孔陰離子（D380）固定化后酶活力卻很低，這可能由于雖然大孔吸附樹脂比表面積大、吸附能力強，由于過強的吸附可能使酶分子的空間構象發生變化導致酶的失活[26]；或者由于固定化后，空間位阻會直接影響到活性中心對底物的定位作用。綜合單位固定化酶活性及固定化率兩個指標，D151可作為固定化胰蛋白酶的載體。

2.2 單因素實驗

按照1.3.3的方法，研究各單因素條件對固定化酶活力的影響，以各自最高的酶活力為100%，不同條件下的相對酶活力結果見圖1。

圖1的實驗結果表明，D151樹脂吸附胰蛋白酶1.5 h后固定化酶的活力不再增加，因為過量吸附的胰蛋白酶致使空間位阻增大，阻礙其與底物的接觸及產物的擴散，而使得酶活力下降。戊二醛質量分數為1.0%時，制備的固定化酶的活力最高，戊二醛質量分數低時，交聯的酶量少，導致固定化酶在沖洗的過程中部分脫落，酶活低；當戊二醛質量分數過高時，吸附的酶被過度交聯導致酶的空間構象被破壞，酶活力降低。隨著加酶量的增大固定化酶的活力逐漸增加，當加酶量過多時，酶在載體表面的吸附達到飽和，部分酶會進入載體孔內部，無法與底物作用，加酶量為8.0 mg/mL的時候酶活力最高。固定化pH為5.0時酶活力最高，這是因為一方面，胰蛋白酶的等電點為10.8，在pH 5.0的環境中，胰蛋白酶帶正電，與載體發生離子交換吸附，酶吸附的效果好；另一方面，環境的pH值直接影響酶分子的酸性、堿性氨基酸殘基側鏈基團的解離狀態，影響酶與底物的親和力。交聯時間為3.5 min時固定化酶活力高。交聯溫度為30℃時酶活力高，溫度過高會導致微波的功率過大，破壞酶的空間結構使酶的活力降低。

圖1 吸附時間、戊二醛質量分數、加酶量、pH、交聯時間及交聯溫度對酶活力的影響Fig.1 Effect of adsorption time，glutaraldehyde concentration，dosage of trypsin，pH，crosslinking time and crosslinking temperature on relative activity of immobilized trypsin

2.3 響應面實驗

在單因素實驗結果的基礎上，選取對固定化酶的活力影響顯著的3個因素加酶量、pH、交聯溫度作為主要的影響因素，采用CCD-RSM設計三因素五水平實驗，響應面實驗設計及結果見表3。

表3 響應面實驗設計及結果Table3 Design and results of response surface design

2.4 二次回歸方程擬合和方差分析

如表4所示，模型的P值＜0.0001，而失擬項P值＞0.05不顯著，說明模型是可靠的?；貧w方程各項的方差分析結果表明，各因素對固定化酶活力的影響依次為：交聯溫度＞加酶量＞pH。交聯溫度是對回歸模型影響最顯著的因素，很可能是因為較高強度的微波振蕩會破壞了酶的空間結構[18]。方程的一次項A和B的P值均小于0.01，一次項C的P值＜0.0001，是極顯著的；而交互項AB、AC、BC的P值均大于0.05，是不顯著的。

加酶量、pH及交聯溫度3個因素兩兩交互影響固定化酶活力的三維空間曲面圖見圖2。由圖2中曲面線的陡峭和平緩可以直觀地看出各因素對固定化酶活力的影響程度，曲線越陡峭，則該因素對響應值的影響程度越大；而等高線的圓心處是極值所對應的條件。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Regression equation variance analysis

圖2 兩因素交互作用對酶活力影響的響應面圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the interaction of every two factors on immobilized trypsin activity

去除不顯著的交互項AB、AC、BC，利用Design-Expert 8.0.5對實驗結果進行擬合，以酶活力y為響應值，得到對自變量加酶量A、pHB和交聯溫度C3個因素的回歸方程為：y=-2025.8564+114.8252A+310.9090B+68.3877C-7.0426A2-30.7336B2-1.1798C2。調整后的回歸模型（P＜0.0001）極顯著；該模型R2=0.9945，RAdj2=0.9919，模型與試驗擬合程度高，自變量與響應值之間的線性關系顯著，可以用于不同變量條件下的響應值預測。失擬項P值由0.2648變為0.2223，因此去掉不顯著的交互項可以使方程的擬合效果更好[27]。

2.5 最優條件驗證實驗

調整后的回歸模型預測固定化酶的最佳工藝條件為：加酶量8.15 mg/mL、pH 5.05、交聯溫度29.00℃，在此條件下酶活力的預測值為219.98 U/g。考慮到實驗的可操作性，修正最佳工藝條件為，加酶量8.2 mg/mL、pH 5.0、微波溫度29.0℃。在此條件下進行3次平行驗證實驗，固定化胰蛋白酶的活力為221.5 U/g樹脂，相對誤差為0.69%，與預測值接近。

2.6 固定化酶的性質

2.6.1 溫度穩定性 測定固定化胰蛋白酶在不同溫度時的酶活力，結果見圖3。

固定化酶在25～45℃的溫度范圍內較穩定，在65℃放置3 h后酶活力下降了一半多，其酶活力是35℃的46.5%。這可能是由于酶被固定化后其分子整體運動受限[28]，抑制了自身構象的解折疊，同時減少了分子間相互作用的機會，從而熱穩定性增加。

圖3 固定化酶的溫度穩定性Fig.3 Temperature stability of immobilized trypsin

2.6.2 酸堿穩定性 測定固定化胰蛋白酶在不同pH時的酶活力，結果見圖4。

圖4 固定化胰蛋白酶的酸堿穩定性Fig.4 pH stability of immobilized trypsin

固定化酶在pH 5.0左右的酸性條件下及pH 9.0～10.0范圍內較為穩定。胰蛋白酶被固定化后其空間結構的改變使其與氫離子的作用與原來不同，所以固定化酶適合的pH發生了改變。

2.6.3 重復使用性 以第一次使用后的酶活力為100%，換算出不同使用次數后固定化酶的相對酶活力，結果如圖5所示。

圖5 固定化胰蛋白酶的重復使用性Fig.5 Reusability of immobilized trypsin

每次反應結束之后用蒸餾水清洗的固定化酶隨著使用次數的增加，酶活力迅速下降。每次反應結束后用緩沖溶液清洗的固定化酶具有較好的重復使用性，酶活力下降遲緩。緩沖液有利于固定化酶活力的保存的結果表明，固定化酶所處環境的離子狀態對固定化酶空間結構的維持具有重要作用。

2.6.4 儲藏穩定性 測定儲藏不同時間后的固定化酶的活力，結果如圖6所示。

圖6 固定化胰蛋白酶的儲藏穩定性Fig.6 Storage stability of immobilized trypsin

固定化胰蛋白酶儲藏一周后發生較大幅度的活力下降，第二周的酶活力是初始酶活力的87.3%，隨后幾周酶活力降低較少，儲藏5周后酶活力仍保留了初始酶活力的71.1%。

2.7 固定化胰蛋白酶的應用

在50℃、固定化胰蛋白酶在pH 9.0，游離胰蛋白酶在pH 8.0的條件下，酶解底物質量分數為4%的酪蛋白溶液。將水解液分別冷凍干燥后進行HPLC分析，如圖7所示。

加入相同酶活力的兩種酶水解酪蛋白后，固定化胰蛋白酶水解產物及游離胰蛋白酶水解產物的水解度分別為14.8%和9.6%。從液相色譜圖中可以看出，固定化胰蛋白酶水解產物與游離胰蛋白酶水解產物總體上差別不大，但在保留時間為3.2 min（峰 2）、20.1 min（峰 3）及 26.8 min（峰 5）處的峰響應值明顯大于游離胰蛋白酶水解產物，且在保留時間為12.9、16.1、34.5 min處還存在一些游離胰蛋白酶水解產物中沒有的小峰；而游離胰蛋白酶水解產物在 2.3 min（峰 1）、26.0 min（峰 4）處吸收峰的響應值大于固定化胰蛋白酶水解產物。這可能是由于胰蛋白酶被固定化后其與底物的親和力發生了變化，所以固定化胰蛋白酶水解產物與游離胰蛋白酶水解產物略有不同，不過在水解度方面明顯優于游離胰蛋白酶。

圖7 酪蛋白及其水解產物的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of casein and its hydrolysates

3 結語

在微波輔助的條件下，以D151樹脂為固定化載體制備出固定化胰蛋白酶。通過單因素實驗和CCD-RSM優化確定了微波輔助固定化胰蛋白酶的最佳條件：吸附時間1.5 h、戊二醛質量分數1.0%、加酶量8.2 mg/mL、pH 5.0、交聯溫度29℃以及交聯時間3.5 min。整個制備過程大約僅需要2 h，制備的固定化胰蛋白酶的溫度及pH使用范圍較游離酶更廣；使用緩沖液沖洗固定化胰蛋白酶可以重復使用多次，并能保留大部分的酶活力；儲藏5周后酶活力仍保留了初始酶活力的71.1%。通過比較固定化胰蛋白酶和游離胰蛋白酶水解酪蛋白的效果，發現固定化胰蛋白酶水解效率更高且產物種類更豐富。

目前，已經有研究將醛縮酶[18]、青霉素?；竅20]、漆酶[24]等用來微波固定化，其結果表明，在固定化時間大大減少的同時能夠保持酶的優異的催化性能；而微波固定化的嗜熱菌蛋白酶催化活性甚至有所提高[23]，表明微波固定化酶的方法是可取的。