恒溫實時熒光法快速檢測不同樣品中的單增李斯特菌

張文敏， 石育嬌， 戚 成， 田明勝， 朱 智， 殷榮永，鐘少水， 王大鵬， 何更生， 馮元琦， 董慶利*

（1.上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海食品藥品監督管理局，上海 200021；3.上海捷易生物科技有限公司，上海 201210；4.上海交通大學 農業與生物學院，上海 200240；5.復旦大學 公共衛生學院，上海 200433；6.廣州迪澳生物科技有限公司，廣州 510663）

單增李斯特菌是一種人畜共患的病原菌，在大多數食品中都能找到該菌。食品中存在的單增李斯特菌感染健康人體后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增生[1]，因此，很多國家都已經采取措施來控制食品中的單增李斯特菌[2]，我國也將單增李斯特菌定為進出口食品的重要檢測衛生指標之一[3]，并且在我國食品安全國家標準中也詳細列出了單增李斯特菌的檢驗方法[4]；國家標準檢驗方法雖然準確可靠，但存在檢驗周期長（最少需要4 d）和鑒定過程工作量大等不足，降低了食品安全監測效率和力度，不能滿足臨床快速診斷的需要。

隨著現代分子生物技術的發展和廣泛應用，對單增李斯特菌的檢驗方法從傳統的生化分離鑒定過渡到以DNA探針技術、基因芯片技術、PCR等為主的現代分子生物技術手段[5-6]。目前，國內外許多臨床機構已經將PCR技術應用于單增李斯特菌的快速檢測，PCR方法敏感、快速，在實驗室檢測中應用最為廣泛[7]；但是該方法容易引起交叉污染，而且需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員有較高的技術要求，難以在基層普及和推廣[8]。

DNA環介導恒溫擴增技術 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）分別使用一對外部引物和一對內部引物識別目的序列上6個特定區域，在等溫條件下高效擴增核酸，1 h左右即可完成[9]。該方法不需要進行模板的預變性，減少了PCR技術升降溫帶來的影響以及對精密昂貴實驗儀器的要求。LAMP陽性擴增反應會產生大量的類似花椰菜結構的產物和白色焦磷酸鎂沉淀，可直接用肉眼觀測或在反應體系中加入染料，根據顏色的變化進行判斷。肉眼觀測方法存在人為判斷主觀性，可能產生錯檢、漏檢；加入染料法需要在LAMP反應終止時打開反應管的管蓋，極易導致反應體系被污染，檢測結果出現假陽性。為適應高靈敏度現場檢測的需求，近年來基于LAMP技術開發的便攜式實時恒溫擴增儀已被應用于微生物快速檢測中[10-12]。

作者以LAMP技術和熒光技術相結合，應用便攜式熒光恒溫擴增儀收集反應管內單增李斯特菌的核酸擴增熒光信號，獲得實時核酸擴增生成量，進而確定待測樣品中是否含有目的基因，探討恒溫實時熒光法快速檢測乳制品中和臨床腹瀉樣本中的單增李斯特菌的可行性，為進出口乳制品及臨床診斷中單增李斯特菌的檢測提供一種快速靈敏、簡單經濟、客觀準確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

標準菌株單增李斯特菌 （ATCC 19116血清型4c）：作者所在實驗室保存；

Bst大片段 DNA聚合酶、0.8～1 mol/L甜菜堿、1.6～2 mmol/L dNTP、20～25 mmol/L Tris-HCl、10～12.5 mmol/LKCl、10 ～12.5 mmol/L（NH4）2SO4、8 ～10 mmol/L MgSO4、質量分數0.100%～0.125%TritonX-100、10～20 mmol/L pH 8.0 的 Tris-HCl、1～2 mmol/L EDTA、質量分數1.0%～1.2%Triton X-100和引物，熒光染料SYBR Green I，細菌基因組DNA快速提取試劑盒，廣州迪澳生物科技有限公司產品；擴增緩沖液、DNA Ladder Marker、TGG：Takara 公司公司；質量分數0.8%NaCl溶液、0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯 （TSB-YE）、BHI培養基 （Brain Heart Infusion）、PALCAM單增李斯特菌選擇性培養基、李氏增菌肉湯基礎培養基（LB）、李斯特氏菌顯色培養基、瓊脂粉：北京陸橋生物技術責任有限公司產品。

1.2 儀器與設備

離心機、Deaou-308C型恒溫擴增儀：廣州迪澳生物科技有限公司產品；XW-80A型漩渦混合器：上海滬西分析儀器廠有限公司產品；YXQ-LS-75S11型滅菌鍋：上海博訊實業有限公司產品；S·SW-CJ-IC型凈化工作臺：上海躍進醫療器械廠產品；MJ-250-（Ⅱ）型霉菌培養箱：上海躍進醫療器械廠產品；電磁爐：上海慧儀儀器廠產品；JJ500型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠產品；100-1000 μL移液槍：德國Eppendorf公司產品；PCR儀（Gene Amp?PCR system 9700）、凝膠成像儀:香港Gene Company Limited基因有限公司產品。

1.3 菌株鑒定

為確保實驗結果的可靠性，實驗室保存的標準菌株在李斯特菌顯色培養基上劃線鑒定，以確保該菌沒有未被污染。之后將該菌株分別以BHI、LB1和LB2營養肉湯為增菌液，在37℃搖床中培養24 h（培養至第四代）， 用引物 （hly F：TGACGAAAT GGCTTACAGTG，hly R： AATGGGAACTCCTGGTGT T）對單增中的特異性基因hly進行PCR擴增。PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 反應體系的建立

1.4.1 引物設計 LAMP引物序列由廣州迪澳生物科技有限公司提供[13]，該引物經檢測具有特異性。

表1 擴增基因的LAMP引物序列Table1 Sequence of LAMP primers for amplification

1.4.2 DNA模板制備 分別取不同樣品不同含菌濃度為1mL的增菌液，10000 r/min離心3 min，棄上清液；渦旋混勻DNA提取液，向沉淀中加入100 μL DNA提取液，渦旋混勻，100℃加熱5 min；10000 r/min離心3 min，將上清液轉移至新的離心管備用，即為DNA模板[14]。

1.4.3 LAMP反應體系的的配置 參考文獻 [12]建立23 μL的反應體系包括：BstDNA聚合酶大片段（8U/μL），2 mmol/L dNTP，25 mmol/L Tris-Cl，12.5 mmol/L KCl，12.5 mmol/L（NH4）2SO4，10 mmol/LMgSO4，質量分數 0.125%TritonX-100，1 mol/L 甜菜堿，內引物FIP和BIP各2 mol/L和外引物F3/B3各 0.20～0.25 mol/L，pH 8.0 的 Tris-HCl 20 mmol/L，2 mmol/L EDTA和質量分數1.2%Triton X-100，0.2 μmol/L SYBR Green I。

1.5 靈敏度及最低檢測限實驗

實驗室制備不同濃度的單增李斯特菌菌液（ATCC 19116血清型4c），用平板計數法測定菌濃度，以DNA提取液提取不同濃度單增李斯特菌的DNA，以各濃度梯度的2 μL DNA作為模板進行反應，檢測該方法檢測單增李斯特菌基因組DNA的靈敏度及最低檢測限。

1.6 樣品檢測

1.6.1 乳制品樣本檢測 實驗選取15份乳酪樣本（前期檢測均不含單增李斯特菌），利用該方法對其進行快速檢測，同時利用國標（GB 4789.30-2010）法計數，以驗證該方法的適用性[15]。

1.6.2 腹瀉物樣本檢測 單增李斯特菌感染健康人群極易出現腹瀉嘔吐癥狀，臨床治療需要快速確定病人病因[16]。因此實驗選取20份腹瀉樣本（前期檢測均不含單增李斯特菌），利用該方法對其進行快速檢測，同時利用國標（GB 4789.30-2010）法計數，以驗證該方法的適用性。

1.7 擴增反應

在上述含有混勻LAMP反應體系的PCR管中分別加入2 μL各樣品的DNA模板（加樣順序為陰性對照、待檢樣品、陽性對照），蓋好管蓋，10000 r/min離心30 s，上述陰性對照為無菌雙蒸水，陽性對照為單核增生李斯特菌基因組DNA。取陰性對照、陽性對照及樣品放入恒溫擴增儀中，63℃反應45 min。

結果判定如下：若有“S”型擴增曲線且出峰時間＜30 min，則判斷為陽性，含有單增李斯特菌；若有“S”型擴增曲線且出峰時間≥30 min，則判斷為可疑樣本，需進行復檢；若無“S”型擴增曲線，則判斷為陰性，不含有單增李斯特菌或含量低于檢測限。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

凝膠成像結果如圖1所示，使用引物 （hly F：TGACGAAATGGCTTACAGTG，hly R： AATGGGAA CTCCTGGTGTT）對實驗樣本接種菌株進行鑒定時，2泳道擴增出與預期大小（535 bp）一致的條帶，進一步進行DNA測序，將序列拼接后在NCBI網站進行序列特異性比對，比對結果相似度為100%，判定實驗樣本接種菌株是單增李斯特菌標準菌株。

圖1 實驗接種菌株鑒定結果Fig.1 Identification ofLis.monocytogenes in the experimental samples by PCR analyses

2.2 靈敏度及最低檢測限

采用國標法測定各濃度梯度的單增李斯特菌菌落濃度。以DNA提取液提取1.5所述各濃度下菌體的DNA，以各梯度的DNA模板進行反應，檢測該方法對提取的基因組DNA的靈敏度及最低檢測限。隨機選取一組實驗結果2，由圖2可知，恒溫實時熒光方法檢測單增李斯特菌DNA的靈敏度可達到102CFU/ml。將各組實驗擴增峰出現時間匯總，結果見表2。該方法檢測單增李斯特菌基因組DNA的假陽性為0。102CFU/mL的基因組DNA為模板時，12份陽性樣本檢出率為75%，而103CFU/mL及以上濃度的基因組DNA為模板時，陽性檢出率為100%，因此恒溫實時熒光方法檢測單增李斯特菌基因組DNA的最低檢測限定為103CFU/mL。

圖2 恒溫實時熒光法檢測純培養時單增李斯特菌基因組的靈敏度和檢測限Fig.2 Sensitivity and detection limit on genomic DNA of Lis.monocytogenes in pure cultures by real time fluorescence isothermal amplification

表2 恒溫實時熒光法檢測純培養時單增李斯特菌的擴增峰出現時間Table2 Amplification peak of Lis.monocytogenes in pure cultures by real time fluorescence isothermal amplification

2.3 乳制品檢測結果

采用國標法測定各濃度梯度的單增李斯特菌菌落濃度；用DNA提取液提取1.6.1所述各樣本的菌體DNA；以各梯度的DNA作為模板進行反應，驗證該方法對乳制品中單增李斯特菌快速檢測的適用性，隨機選取一組實驗結果如圖 3，結果表明，恒溫實時熒光方法檢測單增李斯特菌污染的乳制品樣品，靈敏度可達102CFU/ml。

由表3可知，該方法檢測乳制品中單增李斯特菌DNA的假陰性為0.02%，其中有兩份是可疑樣品，復檢后結果表現為陽性；在增菌液濃度為102CFU/mL，乳制品中單增李斯特菌的檢出率為83%；在增菌液濃度為103CFU/mL及以上濃度時，乳酪中單增李斯特菌的檢出率接近100%；因此檢測限規定為103CFU/mL。其中在增菌液濃度為104CFU/mL時，出現了假陰性，這可能與DNA提取、反應體系配置及加樣過程等的實驗操作有關，需要實驗人員操作過程細心謹慎。在陰性樣本檢測時，出現了假陽性現象，這可能是操作過程中樣品被污染有關；因此，在恒溫實時熒光法檢測單增李斯特菌時要注意樣品配置、DNA提取、反應體系配置及加入DNA模板過程分區進行，且實驗過程要保持通風，以提高實驗準確率。

圖3 恒溫實時熒光法檢測乳制品中單增李斯特菌基因組的靈敏度和檢測限Fig.3 Sensitivity and detection limit on genomic DNA of Lis.monocytogenes in dairy products by real time fluorescence isothermal amplification

表3 恒溫實時熒光法檢測乳制品中單增李斯特菌的擴增峰出現時間Table3 Amplification peak of Lis.monocytogenes in dairy products by real time fluorescence isothermal amplification

2.4 腹瀉樣品檢測結果

由前面實驗結果可知恒溫實時熒光法檢測單增李斯特菌基因組DNA的檢測限為103CFU/mL，因此在進行腹瀉樣本檢測時直接污染腹瀉樣品至單增李斯特菌濃度為103～104CFU/mL，用DNA提取液提取1.6.2所述各樣本的菌體DNA作為模板進行反應，驗證該方法對臨床腹瀉樣本中單增李斯特菌快速檢測的適用性；隨機選取一組實驗結果如圖4所示，表明所有陽性樣本均能在30 min之前出現擴增峰。樣本擴增峰出峰時間見表4。所有被檢陰性樣本均未出現假陽性現象，因此將LAMP技術和熒光技術相結合，應用便攜式時熒光恒溫擴增儀對單增李斯特菌進行快速檢測，可有效降低假陽性現象發生。陽性樣品檢出率為92%，其中未被檢出的陽性樣本主要出現在其中一組實驗中，在進行國標法對這些陽性樣本進行計數時發現只有幾個菌落生長，因此判斷是對樣本接種菌液時出現了問題。

圖4 恒溫實時熒光法檢測腹瀉樣品中單增李斯特菌基因組的靈敏度Fig.4 Sensitivity and detection limit on genomic DNA of Lis.monocytogenes in clinical diarrhea by real time fluorescence isothermal amplification

表4 恒溫實時熒光法檢測腹瀉樣品中單增李斯特菌的擴增峰出現時間Table4 Amplification peak of Lis.monocytogenes in dairy products by real time fluorescence isothermal amplification

3 結 語

1）以LAMP技術和熒光技術相結合，應用便攜式時熒光恒溫擴增儀通過采集熒光信號對擴增產物實時監控，比傳統的檢測濁度的LAMP技術更加靈敏、準確，快速，整個實驗可在45 min內完成；整個擴增過程在閉合管道中進行，減少熒光法檢測LAMP結果產物時，因開蓋添加染料導致反應體系被污染，產生假陽性結果的概率；而且該儀器可精確地控制反應溫度和時間，并且通過可視化軟件直接將擴增結果數據化、自動化、形象化，可實驗對檢測樣本實時監控。

2）恒溫實時熒光快速檢測方法檢測實驗室純培養、乳制品樣品和臨床病人腹瀉樣本中單增李斯特菌，其靈敏度均可達到102CFU/mL，檢測限均為103CFU/mL；假陽性率很低，分別為 0、0.03%、0，在檢測限及以上濃度時，陽性檢出率分別為100%、99%、92%；綜上所述，單增李斯特菌的恒溫實時熒光快速檢測方法靈敏度高、準確性高、操作簡單、反應速度快、成本較低、穩定性較好，并且可以實時觀察擴增情況，為單增李斯特菌的快速檢測提供了新方向。

3）在實驗過程中要盡可能防止污染，避免假陽性出現。