復合酶法提取蘋果渣中的果膠及產品性質分析

王艷翠， 盧韻朵， 史吉平， 劉 莉， 李保國*

（1．上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093；2．中國科學院 上海高等研究院，上海 201210）

目前中國已成為世界上最大的蘋果濃縮汁生產國及出口國[1]，每年因生產蘋果濃縮汁可排出約150萬噸蘋果渣[2]，但大部分果品加工廠的果渣都未得到合理利用，主要作為飼料或丟棄，造成資源浪費和環境污染[3]。在食品行業中，果膠廣泛應用作乳化劑、增稠劑、凝膠劑、穩定劑等，除此，在紡織、造紙、化妝品等行業也都有所發展[4-5]。在全世界每年果膠的消耗量達3萬多噸，且需求量每年增長4%～5%，而我國的果膠產品不僅產量低且質量不高，相比于國外的果膠產品嚴重缺乏競爭力[6]。蘋果渣富含果膠，可作為制備果膠的原材料[7]，從其中提取果膠，具有良好的經濟效益和社會效益[3]。目前，工業生產常用酸法提取果膠，果膠提取率低，環境污染較大[8]。

酶法提取果膠是利用酶分解植物組織細胞壁中的纖維素、半纖維素、蛋白質，從而破壞細胞壁結構，減少溶劑提取時來自細胞壁和細胞間質的阻力，將果膠釋放溶于水中。有研究表明，采用單一酶法[9-10]，如纖維素酶、半纖維素酶能夠提高果膠得率。有研究報道不同種類的酶[8，11-13]從其他原材料如向日葵、柑橘皮中相復合提果膠產品，且實驗效果也優于單一的酶法提取，但幾種酶協同作用從蘋果渣中提取果膠卻鮮有研究報道。

作者以蘋果渣作原材料，通過復合酶法提取果膠，并結合響應面實驗進行優化提取工藝[14]，以期探索提高果膠產量和質量的新工藝，提高蘋果渣的綜合利用價值，解決環境污染問題，為酶法提取蘋果渣果膠的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣：市售蘋果榨汁后果渣烘干、粉碎；無水乙醇、半乳糖醛酸（AR）：國藥集團化學試劑有限公司產品；咔唑（AR）：生工生物有限公司；纖維素酶：上海尤特爾生化有限公司產品；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰酶：南寧龐博生物有限公司產品；木聚糖酶、淀粉酶：白銀賽諾生物科技公司產品。

1.2 儀器與設備

水浴恒溫振蕩器、ZRD-5211鼓風干燥箱：上海智城公司產品；冷凍離心機：日立儀器有限公司產品；H1全功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司產品；CBM-20A高效液相色譜儀：日本島津有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統酸法提取果膠 稱4 g蘋果渣置于三角瓶中，按固液質量體積比1 g∶15 mL加鹽酸溶液，調節體系的pH值為1.5。放置恒溫水浴搖床中，溫度90℃，轉速180 r/min，提取2 h。提取結束定容至100 mL，取30 mL溶液15000 r/min離心15 min。移取20 mL上清液，加入60 mL無水乙醇，使乙醇終體積分數為75%，室溫沉淀1 h，過濾，固體烘干，計算粗果膠得率。

1.3.2 果膠的酶法提取 稱4 g蘋果渣置于三角瓶中，按固液質量體積比1 g∶15 mL加蒸餾水60 mL，調節體系的pH值為酶的最適pH值，分別添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶。放置恒溫水浴搖床中，溫度50℃，轉速180 r/min，提取3 h，煮沸5 min滅酶活。提取結束后定容至100 mL，取30 mL溶液15000 r/min離心15 min。移取20 mL上清液，加入60 mL無水乙醇，使乙醇終體積分數為75%，室溫沉淀1 h，過濾，固體烘干，計算粗果膠得率，考察不同酶及其用量對果膠得率的影響。

1.3.3 酶法提取果膠的響應面優化 采用四因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）實驗設計，以pH 值（A）、溫度（B）、時間（C）、固液質量體積比（D）為自變量，以粗果膠得率為響應值，優化最佳酶法提取果膠的條件。實驗設計見表1。

1.3.4 粗果膠得率 將醇沉過濾后的沉淀物放入105℃烘箱，烘干至恒重，冷卻后稱量，計算粗果膠得率。

式中：x為粗果膠得率，%；m0為烘干后果膠沉淀質量，g；V為果膠提取液總體積，mL；v為用于醇沉的果膠上清液體積，mL；m1為實驗樣品中蘋果渣的質量，g。

表1 響應面分析因素水平設計Table1 Factors and levels in response surface analysis

1.3.5 果膠性質分析 將提取得到的果膠復溶于水中，形成均勻的溶液，用于以下性質分析：

1）果膠中半乳糖醛酸含量的測定 半乳糖醛酸是果膠中的主要成份，其在硫酸溶液中與咔唑試劑反應生成紫紅色絡合物，該絡合物在波長525 nm處有最大吸收。 配制 0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g/L的半乳糖醛酸標準溶液，分別取1 mL于6支離心管內。加入0.25 mL質量分數為0.15%咔唑乙醇溶液，混勻后迅速加入5 mL質量分數98%濃H2SO4溶液。85℃水浴10 min，冷水浴30 min。在波長525 nm下測定吸光值，并繪制標準曲線，其中橫坐標為半乳糖醛酸的濃度，縱坐標為吸光值。

以提取溶劑替代樣品溶液作空白對照，測定吸光值，方法同上。公式如下：

式中：X為實驗樣品中的半乳糖醛酸質量分數，%；c為根據標準曲線得到的半乳糖醛酸質量濃度，g/L；V為果膠提取液的總體積，L；N為提取液的稀釋倍數；m為烘干后粗果膠沉淀的質量，g。

2）果膠酯化度的測定[15]取5 mL均勻的果膠溶液，加100 mL水，滴加酚酞。用0.02 mol/L的NaOH滴定，記錄消耗的體積V1；加入NaOH（0.5 mol/L）溶液 20 mL，攪拌 15 min后；再加鹽酸（0.5 mol/L）標準溶液20 mL，攪拌15 min至粉紅色消失后，再滴入酚酞。然后用NaOH（0.02 mol/L）標準溶液滴定至終點（粉紅色）。記錄滴定的體積V2。計算酯化度DE值。

式中：V1為初滴定值，L；V2為皂化滴定值，L；c1為氫氧化鈉濃度mol/L；c3為鹽酸的濃度，mol/L；V3為鹽酸的體積，mL；c4為氫氧化鈉的濃度，mol/L，V4為氫氧化鈉的體積，mL。

3）果膠相對分子質量的測定 采用高效液相色譜法對果膠相對分子質量進行測定。色譜條件為：凝膠色譜柱TSK gel Super Multipore PW-H，進樣量20μL，流動相H2O，流量0.4 mL/min，柱溫35℃，示差折光檢測器RID進行檢測。相對分子質量分別為12600、110000、289000葡聚糖為標準樣，繪制出峰保留時間t與標準樣分子量的標曲，果膠樣品相對分子質量按照標曲計算。

2 結果與分析

2.1 不同種類酶對果膠提取效果的影響

圖1為酶用量為蘋果渣質量的5%，固液質量體積比 1 g∶15 mL，溫度50℃，反應時間3 h時，酶的種類對粗果膠得率的影響。從圖1可以看出：酸法提取中粗果膠得率26.84%；不同種類酶對果膠得率的影響不同，其中添加木聚糖酶的溶液粗果膠得率最高，為35.22%；其次為纖維素酶，達到33.56%；酸性蛋白酶達到32.23%。在后續實驗中將此3種酶進行復配用于提取蘋果渣中的果膠。

圖1 酶的種類對粗果膠得率的影響Fig.1 Effect of enzymes on the yield of crude pectin

2.2 酶用量對果膠提取效果的影響

圖2所示不同酶用量（質量分數）下的纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶對蘋果渣粗果膠得率的影響，據圖2可知，從一定的范圍內來看，隨著酶使用量的不斷增多，明顯看到粗果膠得率亦隨之增多，待增加到一定的數值之后，酶用量再增加，粗果膠得率不再明顯升高，說明此時酶的用量已經趨于達到飽和狀態，結合考慮實際成本等因素，最終確定此3種酶的最佳用量（質量分數）分別為：纖維素酶7%、木聚糖酶9%、酸性蛋白酶5%。

圖2 酶質量分數對粗果膠得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the yield of crude pectin

2.3 酶法提取果膠響應面優化實驗結果與分析

在確定了最優酶的種類及用量基礎上，選擇自變量為 pH 值（A）、溫度（B）、時間值（C）、固液質量體積比（D），響應值為粗果膠得率（Y），采取四因素三水平的響應面實驗設計，利用統計軟件Design-Expert V8.0.6優化酶法提取果膠的最佳條件。實驗方案及結果見表2。

表2 酶解條件響應面實驗設計及結果Table2 Designs and results of experiment of enzymatic hydrolysis conditions by response surface methodology

通過Design-Expert.V8.0.6軟件對表2中測得的實驗結果進行回歸方程擬合，得到相應值（Y）與pH 值（A）、溫度（B）、時間（C）、液固質量體積比（D）的二次多項回歸方程如下：

表3為響應面實驗回歸模型方差分析結果。從表3的檢驗結果可知，酶解條件模型p＜0.0001，說明此回歸模型極顯著；失擬項p值為0.05＜p=0.0621不顯著，說明擬合的回歸方程情況較好；且該模型復相關系數和校正系數分別為R2=0.9603，R2Adj=0.9206，說明模型的預測值與實測值呈現高度的相關性，分別能解釋96.03%和92.06%的響應值變化。離散系數CV較低（0.77），說明實驗穩定性高，結果可靠。綜上可知該模型擬合較好，酶解提取蘋果渣果膠的實驗條件可用該模型作進一步的預測和分析。

由表3中P值可知，時間的一次項影響極顯著；溫度和固液比兩個因素的一次項影響顯著；pH、溫度、時間3個因素的二次項影響極顯著。由方差分析表F值知 ：FA=0.57，FB=12.34，FC=147.87，FD=4.53，各因素對粗果膠得率的影響順序為：C>B>D>A，即時間＞溫度＞固液質量體積比＞pH值。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial

利用Design-Expert V8.06軟件對實驗數據進行分析，得到交互作用顯著的酶解溫度（B）和pH值（A）的響應面圖如圖3所示，由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，粗果膠得率也會隨著增大，當酶解溫度升高到50℃后，繼續提高酶解溫度，粗果膠得率下降；隨著酶解pH值的增大，粗果膠得率也會隨著增大，當酶解pH值增大到4.0后，繼續增大酶解pH值，粗果膠得率隨著下降。原因可能是隨著溫度和pH值的增大，超過了復合酶反應的最適溫度和pH值范圍，影響了酶的活性，進而影響粗果膠得率。因此工業上生產需嚴格控制反應溫度和pH值。

過模型預測得到最佳酶解條件：pH值為4.1，溫度為54℃，時間為1.3 h，固液質量體積比為1 g∶16 mL，在該條件下模型預測靈芝粗多糖得率為39.44%。對最優的條件下進行實驗驗證粗果膠得率為40.66%。因此，通過利用響應面實驗優化所得的復合酶法提取粗果膠的參數可供參考。

傳統酸法提取果膠，易出現果膠分子水解和降解現象，進而導致果膠得率低、品質受到影響，除此之外，還具有在提取過程中乙醇需求量多、提取液粘度大、耗時長，能耗高等劣勢；而酶提法具有提取溫度低、提取耗時短，操作條件溫和、安全、無污染、減少提取中能量的消耗等優點。將實驗取得的研究結果與傳統酸法提取蘋果渣粗果膠得率為26.84%相比較，提高了51.49%；與卡吉爾公司[16]酶法提取蘋果糊果膠得率進行比較，該方法中只使用了Genencor Multifect A40酶，溫度 50℃，時間 70 h，粗果膠得率為13.7%。因此，本研究采用復合酶效果提取時間更短，粗果膠得率更高。

圖3 各因素交互作用對粗果膠得率的影響Fig.3 Influence of the interaction of the factors on the crude pectin yield

2.4 酶法提取果膠的性質分析

2.4.1 果膠中半乳糖醛酸質量分數及其酯化度從表4可看出，作者用復合酶法提取所得果膠半乳糖醛酸質量分數和酯化度分別為57.39%和89.41%，與傳統酸法提取所得果膠半乳糖醛酸質量分數64.48%和酯化度56.08%相比，半乳糖醛酸質量分數略低于傳統酸法提取，其可能原因為，由于酶的加入影響了果膠的純度，后續需對其進行進一步分離提純處理，目前膜分離技術在果膠提取中的應用研究較多，它可將果膠純度提高到80%以上[17]。果膠酯化度是影響果膠凝膠時間和凝膠速度的重要因素，亦是評價果膠產品性能的一項重要指標。可分為酯化度大于50%為高酯果膠；酯化度低于50%的為低酯果膠。從酯化度來看，采用復合酶提取和酸法提取得到的果膠均屬于高酯果膠，但前者酯化度遠高于后者。與邸錚[10]酶法從蘋果皮渣提取果膠所得半乳糖醛酸含量和酯化度分別進行比較可知，作者使用復合酶提取所得果膠半乳糖醛酸含量和酯化度均高于單一酶法提取。

表4 果膠中半乳糖醛酸含量及酯化度測定Table4 Determination of galacturonic acid content and the degree of esterification of the pectin

2.4.2 果膠相對分子質量 經過對葡聚糖標準品的測定，得到標準曲線lgMw=-1.0427t+13.574（Mw為葡聚糖標樣的相對分子質量；t為標樣出峰時間，min；R2=0.9972）

酸法與酶法提取的果膠樣品經凝膠柱的相對分子質量分布如圖4所示。酸法提取出的果膠樣品的相對分子質量主要分布在 165.92×103、5.83×103與0.45×103范圍內。酶法提取樣品的相對分子質量主要分布在 217.63×103、16.67×103與 8.17×103范圍內。

圖4 果膠樣品的峰圖Fig.4 Peak of pectin samples

3 結語

對復合酶法提取蘋果渣果膠進行了研究，并對果膠的性質進行了分析。最終得到酶法提取蘋果渣果膠的工藝條件為：添加質量分數7%纖維素酶、9%木聚糖酶和5%酸性蛋白酶，酶解條件為pH值4.1，溫度54℃，時間1.3 h，固液質量體積比1 g∶16 mL。在此最佳條件下，蘋果渣粗果膠得率為40.66%。與傳統酸提法粗果膠得率26.84%相比，提高了51.49%。使用復合酶法提取，反應條件溫和、無污染、粗果膠得率高；所得果膠半乳糖醛酸質量分數為57.39%，果膠酯化度為89.41%，相對分子質量主要分布在 217.63×103、16.67×103與 8.17×103范圍內。與傳統酸法和單一酶法提取相比，果膠品質更高，具有更明顯的商業價值。