血管損傷后TGF-β1/Smad信號通路在誘導BMSCs分化參與血管再狹窄的相關性研究

鄭仕杰 周敬群 楊維華 黃 迪 蔡金丹 戴秋婷 呂建峰

三峽大學附屬仁和醫院心血管內科，湖北宜昌 443000

冠心病發病的主要原因之一是血管內膜損傷后的血管再狹窄。近年來，隨著血管介入治療的廣泛開展，血管損傷后再狹窄問題逐漸增多。有研究結果顯示，在血管介入治療的患者中，術后發生血管內再狹窄幾率可達30%[1]。但目前有關血管損傷后再狹窄的具體病理機制暫不明確。既往研究認為，新生內膜的修復來源于血管損傷后的中膜平滑肌細胞和細胞外基質的參與，這是引起血管再狹窄的重要原因[2-3]。另有研究顯示，血管損傷時其外膜的成纖維細胞可以分化為肌成纖維細胞，參與血管損傷后內膜的增生[4]。但也有文獻報道，新生內膜的平滑肌細胞并非完全來自血管中膜和（或）外膜，BMSCs 可以通過分化參與損傷血管的新生內膜形成[5]。

同時研究發現，TGF-β1/Smad 信號通路與心血管疾病密切相關，在動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的發病中具有重要作用，但具體分子機制尚不明確。本實驗旨在研究血管損傷后是否存在TGF-β1/Smad 信號通路的激活，以及BMSCs 參與血管損傷后重構的相關性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

選取健康雄性SD 大鼠48 只（350 ～450g，三峽大學動物實驗中心提供），建立球囊導管損傷右側頸總動脈損傷模型，按完全隨機對照原則分6 組，每組8 只，即：對照組、實驗0h、3d、7d、14d、21d 組。

1.2 主要試劑及儀器

DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）、胎牛血清（Gibco 生物工程公司）、低糖DMEM（Gibco 生物工程公司）、兔抗人CD33（北京中衫公司）、兔抗人CD34（北京中衫公司）、兔抗人TGF-β1（濃度1 ∶200）（北京中衫公司）、兔抗人p-Smad2/3（濃度1 ∶50）（北京中衫公司）、兔抗人Smad2/3（濃度1 ∶50）（北京中衫公司）、兔抗人Nestin（濃度1 ∶600）Gibco 生物工程公司）、蛋白電泳條Marker、Western Blot 檢測抗體（Gibco 生物工程公司）。PTCA 球囊導管、球囊導管壓力泵、剪刀、鑷子、手術縫合線、圓針、超凈工作及操作臺、低溫高速離心機、奧林巴斯顯微鏡及圖像采集系統、電泳儀、石蠟包埋機等。

1.3 右側頸總動脈損傷模型的建立

SD 雄性大鼠常規備皮、消毒、覆蓋洞巾及麻醉，暴露頸部組織，切開并逐級分離皮膚、肌肉至氣管前，分離出右側頸外動脈，于頸外動脈結扎處近心端用眼科剪剪成小切口，把球囊導管送至頸動脈內，往下送至主動脈弓處，以2 個大氣壓，緩慢拉出至切口處，反復此過程3 次后取出球囊，結扎頸外動脈，恢復血流，觀察血流是否恢復。待血流恢復后，逐層縫合切口，放至飼養箱內。術后觀察大鼠傷口有無紅腫、滲血、死亡，蘇醒后正常進食水。

1.4 取材

（1）分別于術后0h、3d、7d、14d、21d 時，手術取出損傷血管，長度約1cm，行石蠟包埋，切片及保存，以行組織形態學觀察、免疫組化檢測。（2）在術后0h、3d、7d、14d、21d 時，分離出損傷血管段，提取損傷血管組織蛋白，采用Western Blot 檢測各個相關蛋白在損傷血管中的表達情況。

1.5 觀察指標

1.5.1 組織形態學觀察 通過HE 染色及在光鏡下觀察損傷血管新生內膜的增生情況。通過圖像分析處理軟件，以新生內膜區（I，intima）與中膜平滑肌區（M，media）比值（I/M 值）表示新生內膜增生程度。I/M 值越高，代表新生血管內膜增生程度越高，管腔面積越小，血管狹窄越重。

1.5.2 免疫組化檢測 采用Envision 二步法，將切好的鈉膜標本常規脫鈉水，經過加入一抗、二抗、PBS 液浸洗等處理，DAB 顯色后電鏡下觀察。

1.5.3 Western Blot 檢 測 采 用SDS-PAGE 凝 膠不連續緩沖系統進行電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，經過加入一抗、二抗、TBST 液浸洗等處理，待顯色液中顯色，出現條帶時終止顯色，記錄各條帶灰度值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 兩組在不同時間點損傷血管內膜的改變

對照組頸總動脈內膜由單層內皮細胞覆蓋，中膜由平滑肌細胞構成，各時間點未見細胞異常增生及異常細胞形成。

實驗組在術后0h 組、3d 組中，光鏡下可見損傷血管的內皮細胞剝脫，無新生內膜形成；術后7d 組光鏡下可見少許新生內膜形成；14d 組內膜厚度增生明顯，21d 組增生最顯著，見圖1。通過HE 染色，觀察新生血管內膜增生情況，結果顯示，21d 組I/M值明顯高于7d 組、14d 組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表1。

表1 實驗組不同時間點I/M比值

2.2 實驗組各時間點TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3及Ki-67的關系

采用Wstern Blot 檢測不同時間點TFGβ1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表達，結果顯示，TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 的蛋白表達在術后7d 組開始升高，14d 組達到高峰，21d 組下降，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖2。比較實驗組的p-Smad2/3、Smad2/3 灰度值，結果表明，14d 組比值均大于7d 組與21d 組（P ＜0.05），見圖3。

同時，通過免疫組化Ki-67 染色，在不同實驗組計數新生內膜的細胞數量，反應新生內膜細胞的增殖能力。結果顯示，術后14d 組顯著高于7d 組、21d 組，見表2。結果提示，TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表達與細胞增殖同趨勢化，猜測在損傷血管內TFG-β1/Smad 信號通路被激活，促進細胞增殖，參與了損傷內膜的增生過程。

2.3 實驗組各時間點Nestin與TFG-β1的關系

通過Western Blot 法檢測BMSCs 標記物Nestin蛋白，反映血管損傷后MSCs 聚集情況。結果顯示，僅在7d 組及14d 組中有Nestin 蛋白的表達，其表達量結果顯示14d 組高于7d 組（P ＜0.05），這與TGF-β1 的表達量同趨勢化，見圖4。實驗結果提示，損傷血管新生內膜的形成過程，可能與TGF-β1 招募循環中的MSCs 聚集于血管損傷處有關。

3 討論

圖1 實驗組不同時間點血管損傷后內膜形態（HE 染色，×100）

表2 實驗組不同時間點新生內膜Ki-67染色細胞計數

圖2 TGF-β1/Smad 信號通路的蛋白表達

圖3 各實驗組灰度值表達率

圖4 Nestin 的蛋白表達及灰度值比較

近年來，隨著血栓栓塞性疾病的發病率不斷增加，臨床上血管介入性治療得以廣泛開展，但介入性操作不可避免會造成不同程度的血管損傷，導致損傷后發生再狹窄問題也逐漸增多。有研究結果顯示，在行冠脈支架植入的患者中，術后有30%的患者可發生冠脈血管內再狹窄[1]。大量研究認為，血管再狹窄與新生內膜增生有關[6-7]，但損傷后再狹窄的具體機制尚不明確。既往研究[3]認為，血管損傷后新生內膜來源于血管中膜平滑肌細胞積聚及合成細胞外基質沉積是導致血管再狹窄的主要原因。Pei 等[8]經球囊致小鼠頸動脈損傷，觀察新生內膜形成，結果顯示新生內膜中血管平滑肌的增殖和遷移，并增強了細胞外基質的沉積；另有研究[9]顯示，血管外膜的成纖維細胞能夠分化為肌成纖維細胞，參與內膜受損時新生內膜的增生過程。但隨著干細胞的深入研究，人們發現來源于BMSCs 具有多分化潛能，在體外可分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞及平滑肌細胞等，在生長因子及促遷移因子的調控下經過血液能夠向損傷組織遷移并參與修復[10]。馬發鑫等[11]研究炎癥激活BMSCs 對輻射損傷大鼠小腸上皮干細胞的影響時，發現在小腸上皮細胞損傷處檢測到BMSCs 的特異性標記，說明新生內膜的平滑肌細胞除了來源于血管中膜和（或）外膜，還可以通過BMSCs 分化參與損傷血管的新生內膜形成，但刺激或誘導BMSCs 遷移的主要細胞因子目前尚不明確。

TGF-β 生長因子具有多種生物學效應，可激活多個信號傳導通路，而Smads 蛋白是一種信號轉導通路，TGF-β1/Smad 信號轉導通路與動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的發病密切相關[12]。Deepraj G 等[13]研究顯示，在新生內膜增生過程中，TGF-β1 已被證明參與血管平滑肌的形成，且TGF-β1/Smad 信號與體外平滑肌細胞的增殖有關。因而有學者提出，在損傷血管修復過程中，文獻中很少報道BMSCs 是否在生長因子或刺激物的作用下通過TGF-β1/Smad 信號轉導途徑參與新內膜形成和血管重塑。

本實驗以大鼠頸部動脈內膜損傷為實驗對象，在各個實驗時間點選取損傷部位的頸動脈，觀察血管內膜增生及狹窄程度。實驗結果顯示，在損傷后的不同時間點檢測到新生內膜增生的程度不同，以損傷7、14、21d 組新生內膜增生明顯，三組間的差異有統計學意義（P ＜0.05），且21d 組增生程度及I/M 值明顯高于其他組（P ＜0.05）。為進一步檢測TGF-β1/Smad 信號轉導蛋白（TGF-β1、p-Smad2/3，Smad2/3）是否在損傷血管中表達及與細胞增殖關系。實驗結果顯示，TFG-β1、p-Smad2/3及Smad2/3 蛋白表達量在術后7d 組開始升高，14d 組達到高峰，21d 組下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。這與通過免疫組化Ki-67 染色，計數新生內膜的細胞數量的結果趨勢相同，表現為術后14d 組顯著高于7d 組、21d 組。實驗說明，在損傷血管內TFG-β1/Smad 信號轉導通路被激活，促進細胞增殖，參與了損傷內膜的增生過程。

在骨缺損修復的研究中，大量文獻結果顯示BMSCs 可分化為成骨細胞、軟骨細胞，參與新骨的形成。研究還發現，TGF-β 可以誘導骨髓腔中BMSC 定向遷移，參與骨缺損修復，且在缺損處高表達自身標記物[14]。也有研究[15]發現，血管損傷后釋放一些生物活性物質，可以動員BMSCs 進入血液循環，黏附于血管損傷部位，最終分化為血管平滑肌細胞，參與損傷的修復。李羅成等[16]證明BMSCs 參與血管損傷后新內膜的形成，且這些細胞表達平滑肌細胞標志。BMSCs 表達特定的免疫表型，通常強表達CD29、CD44、CD45、CD105、Nestin等。目前通常選用CD29 和Nestin 作為BMSCs 的表面標記。本實驗通過Western blot 法檢測BMSCs標記物Nestin 蛋白在血管新生內膜的表達，發現Nestin 蛋白僅在7d、14d 組及21d 組中表達，這與TGF-β1/Smads 信號轉導通路開始激活時間點相同，進一步說明了，在損傷血管內TFG-β1/Smad 信號轉導通路被激活，誘導了BMSCs 向損傷處聚集、分化及參與內膜增生，但BMSCs 在血管損傷后內膜增生過程中發揮的具體作用機制，尚需進一步研究。