從人類基因組中發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子將成為我國新藥開發(fā)的突破點(diǎn)
——訪北京大學(xué)人類疾病基礎(chǔ)研究中心主任馬大龍

文圖/《中國醫(yī)藥科學(xué)》記者 費(fèi)菲

16 年前的2003 年，人類基因組的測序任務(wù)就已順利完成,但迄今為止仍有約1/3 已注釋的人類蛋白編碼基因無功能報(bào)道。趨化因子和具有趨化活性的蛋白在免疫相關(guān)疾病（如自身免疫性疾病、心血管疾病、代謝病和炎癥腫瘤等）的發(fā)生和發(fā)展中，往往起到關(guān)鍵且不可或缺的作用。發(fā)現(xiàn)具有活性的新細(xì)胞因子,尋找其受體并探索其與機(jī)體生理和病理過程的相關(guān)性，從而為后期研發(fā)新藥鋪路，是目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

眾所周知，細(xì)胞因子創(chuàng)新藥物開發(fā)離不開基礎(chǔ)研究。迄今為止，所有已上市進(jìn)入臨床的細(xì)胞因子藥物全都是國外研究者克隆的，還沒有一個(gè)藥物是我國研究者自己篩選克隆的，在這方面還有不小的差距。然而有了人類基因組計(jì)劃以后，從人類基因組中篩選發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子將有可能成為我國在原創(chuàng)新藥開發(fā)領(lǐng)域的新的突破點(diǎn)之一。20 多年來，北京大學(xué)人類疾病基礎(chǔ)研究中心主任兼中國免疫學(xué)會副理事長馬大龍教授研究團(tuán)隊(duì)始終堅(jiān)持在這個(gè)領(lǐng)域開展工作，獲得了令人鼓舞的新發(fā)現(xiàn)。在國際上首次發(fā)現(xiàn)了凋亡相關(guān)基因PDCD5 和PDCD10、新細(xì)胞因子CKLF 及其超家族CTMTM1-8，已有越來越多的國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證和拓展了這些新領(lǐng)域的研究成果，成果總他引篇數(shù)近1000 次，證明了這些分子的重要功能和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。近日，他結(jié)合多年來實(shí)驗(yàn)室研究工作，介紹了其團(tuán)隊(duì)近年來發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子的研究和進(jìn)展。

馬大龍教授指出，細(xì)胞因子藥物開發(fā)中最具原創(chuàng)性的工作是發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞因子。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的研究策略分為兩種，一是傳統(tǒng)生物學(xué)策略，老的細(xì)胞因子基本上都是利用了傳統(tǒng)的生物學(xué)策略，即先發(fā)現(xiàn)生物學(xué)活性，將其蛋白質(zhì)（細(xì)胞因子）分離出來，進(jìn)行基因克隆，隨后進(jìn)行細(xì)胞水平研究、動(dòng)物模型研究、人體內(nèi)功能及與疾病關(guān)聯(lián)研究，但這一策略非常耗時(shí)，難度極大。二是反向生物學(xué)策略。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，現(xiàn)在基本上新的細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)都采用了反向生物學(xué)的策略，就是利用大規(guī)模的基因測序數(shù)據(jù)，去尋找細(xì)胞因子的編碼蛋白，特別是分泌蛋白（因?yàn)榧?xì)胞因子基本上都是分泌蛋白），在細(xì)胞水平進(jìn)行活性篩選，隨后進(jìn)行動(dòng)物模型研究，最后再進(jìn)行人體內(nèi)功能及疾病關(guān)聯(lián)研究。

在免疫系統(tǒng)中，由各種免疫細(xì)胞分泌的具有調(diào)控細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能和生理活性、參與病理反應(yīng)的小分子分泌蛋白，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）、干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、腫瘤壞死因子（TNF）、趨化因子（chemokine）等，被統(tǒng)稱為細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)是量微而活性極強(qiáng)，也就是非常微量的細(xì)胞因子（比如不到1ng），就會引起很強(qiáng)的生物學(xué)活性。

□馬大龍：發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞因子是細(xì)胞因子藥物開發(fā)中最具原創(chuàng)性的工作

細(xì)胞因子的研究和藥物開發(fā)是密切相關(guān)的。總體來說，細(xì)胞因子的藥物包括以下幾個(gè)種類：第一種是人們比較熟悉的重組細(xì)胞因子藥物，如干擾素、集落刺激因子、白細(xì)胞介素等，都曾在20 世紀(jì)80 ～90 年代成為生物制藥的熱點(diǎn)，在臨床上發(fā)揮了很好的療效；第二種是抗細(xì)胞因子或其受體的中和抗體（如TNF 抗體、VEGF 抗 體、IL-6R 抗 體、IL-17 抗 體、IL-23 抗體），這些抗細(xì)胞因子的藥物已成為生物技術(shù)藥物的非常重要的領(lǐng)域；第三種是可溶性細(xì)胞因子受體藥物（如TNFR、VEGFR）等；第四種是細(xì)胞因子基因治療（如GM-CSF 轉(zhuǎn)染腫瘤疫苗）可治療前列腺癌；第五種是細(xì)胞因子免疫毒素（如IL2-白喉毒素，IL3-白喉毒素），就是將白細(xì)胞介素2 和白喉毒素構(gòu)建成融合蛋白，可用于治療白血病；IL3 和白喉毒素構(gòu)建的融合蛋白最近也剛被批準(zhǔn)用于治療腫瘤；第六種是以細(xì)胞因子信號通路為藥物標(biāo)靶的小分子藥物（如JAK/STAT抑制劑）最近上市。

2019 年4 月，Nature Reviews 報(bào) 道，2018 年 全球TOP10 最暢銷藥物中有4 個(gè)是細(xì)胞因子抑制劑，比如Humira （Abb Vie）、Herceptin（Roche）、Avastin（Roche）、Stelara（Johnson & Johnson）。TOP10 榜上第一名是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的Humira（修美樂），2018 年銷售額接近200 億美元，第10 名是Stelara（ustekinumab）靶向白細(xì)胞介素12（IL-12）和白細(xì)胞介素23（IL-23），治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）。目前兩個(gè)免疫檢查點(diǎn)藥物（通過抑制CTLA-4 和PD-1 分子，使T 細(xì)胞大量增殖從而攻擊腫瘤細(xì)胞，通過解除免疫抑制來控制腫瘤）也已經(jīng)進(jìn)入了TOP10 榜單。

還有一個(gè)重要的發(fā)展趨勢是細(xì)胞因子相關(guān)的藥物上市較快。在2018 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）新批準(zhǔn)的細(xì)胞因子藥物已經(jīng)達(dá)到了9 種，這也是創(chuàng)記錄的。其中包括抗細(xì)胞因子抗體、細(xì)胞因子激動(dòng)劑，如血小板生成素受體（Tpo）激動(dòng)劑、小分子細(xì)胞因子抑制劑，還有IL3-DT 免疫毒素融合蛋白等不同類型的細(xì)胞因子藥物。

2018 年美國FDA 新批準(zhǔn)的細(xì)胞因子藥物也非 常 多。3 月20 日，Sun Pharma 公 司 的IL-23 抗體Ilumya，治療中重度斑塊狀銀屑病。 4 月17 日， Ultragenyx 公司的FGF23 抗體Crysvita（Burosumab），治療X 連鎖低磷血癥（XLH）。5 月31 日，禮來與Incyte 公司小分子JAK 抑制劑baricitinib（Olumiant），治療TNF 抑制劑無效的中重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。7月31 日，Shionogi 公司的血小板生成素受體（Tpo）激動(dòng)劑（Lusutrombopag），治療血小板減少癥。8 月8 日，Kyowa Hakko Kirin 公 司CCR4 抗 體Poteligeo（mogamulizumab-kpkc）上市，治療淋巴瘤中的復(fù)發(fā)或難治性蕈樣真菌病（mycosis fugoides）或塞扎里綜合征。8 月22 日，意大利公司Dompe 的重組人神經(jīng)生長因子（NGF）Oxervate，治療中重度神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎。11 月26 日，Sobi 公司的干擾素γ（IFNγ）抗體Gamifant（emapalumab-lzsg）上市，治療兒童或成年原發(fā)性噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增多癥（HLH）。11 月28 日，Astellas 公司的FLT3 靶向藥物Xospata（gilteritinib），治療FLT3 突變的復(fù)發(fā)性或難治性（藥物難治）急性髓性白血病。12 月24 日，Stemline Therapeutics 公司的IL3-DT 免疫毒素（Elzonris），治療母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤（BPDCN）。2019年已經(jīng)新批準(zhǔn)兩個(gè)細(xì)胞因子藥物，預(yù)計(jì)今年會有6 個(gè)新批準(zhǔn)的細(xì)胞因子藥物，可以說這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展是非常迅速的。

利用反向生物學(xué)策略發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子

如前所述，反向生物學(xué)策略是非常有效的，可以按照不同的技術(shù)路線來進(jìn)行具體的分類。

第一項(xiàng)技術(shù)路線是通過細(xì)胞因子序列同源性比對（如IL19-IL39）。這是目前發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子最多的路線，即利用已知的細(xì)胞因子的氨基酸序列，到數(shù)據(jù)庫里去比對，看哪些未知基因的編碼蛋白和已知的細(xì)胞因子的氨基酸序列有同源性。比如，IL1-IL18 是利用傳統(tǒng)的生物學(xué)策略發(fā)現(xiàn)的，而IL19-IL39 都是利用反向生物學(xué)策略發(fā)現(xiàn)的。

第二項(xiàng)技術(shù)路線是基因Cluster 分析。因?yàn)楹芏嗉?xì)胞因子特別是趨化因子在染色體上是成簇排列的，在某個(gè)集中有細(xì)胞因子染色體的區(qū)域，如果某個(gè)基因的功能未知而又符合小分子的分泌蛋白，也能通過這個(gè)線索來發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子。比如，趨化因子的如17q-CCL18、7q-CCL26 都是利用一策略發(fā)現(xiàn)的。

第三項(xiàng)技術(shù)路線是免疫細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)譜分析。馬大龍實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的CKLF1 蛋白就是使用這一技術(shù)路線。

第四項(xiàng)技術(shù)路線是直接利用基因敲除小鼠模型的表型分析尋找細(xì)胞因子。這是一項(xiàng)更新穎的生物學(xué)策略。2017 年報(bào)道的IL-40/C17 orf 99，就是未知的C17 orf 99 的一個(gè)基因系列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在B 細(xì)胞表達(dá)有特異性，構(gòu)建基因敲除小鼠后，證明這一因子對B細(xì)胞具有調(diào)控作用，將其命名為IL-40，但這一策略的技術(shù)路線不具備普及性。

第五項(xiàng)是利用免疫細(xì)胞篩選模型開展小分子分泌蛋白編碼基因功能篩選。馬大龍實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)分泌蛋白，用這一策略證明了它們是新的細(xì)胞因子，相關(guān)論文均已在國際雜志上發(fā)表。

馬大龍教授首先重點(diǎn)介紹了他的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的新細(xì)胞因子——CKLF1。1985 年底,馬大龍從德國留學(xué)回國以后，多年參與國家“863”生物技術(shù)藥物項(xiàng)目。當(dāng)時(shí)開展了多項(xiàng)細(xì)胞因子研究，特別是細(xì)胞因子基因工程，但當(dāng)時(shí)的細(xì)胞因子均為國外首先克隆的，于是他在心中埋下了一個(gè)夢想，就是希望中國研究者能發(fā)現(xiàn)并克隆新的細(xì)胞因子。然而，依據(jù)當(dāng)時(shí)的條件是很難實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的，因?yàn)橛脗鹘y(tǒng)的生物學(xué)策略去發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子的難度極大。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，馬大龍團(tuán)隊(duì)也開始有條件開展這一領(lǐng)域較有創(chuàng)新的研究。

馬大龍實(shí)驗(yàn)室第一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子就是趨化 素 樣 因 子1（chemokine-like factor 1,CKLF1），是一個(gè)具有廣譜的趨化活性的新細(xì)胞因子。當(dāng)時(shí)，馬大龍的博士生韓文玲的博士論文就是開展這項(xiàng)研究工作，并因此獲得了當(dāng)年的全國優(yōu)秀博士論文獎(jiǎng)。 由于IL-10 是一個(gè)廣譜細(xì)胞因子抑制因子，抑制了很多已知的細(xì)胞因子，因此還可能抑制未知的細(xì)胞因子。他們采取的技術(shù)路線是利用IL-10 為廣譜細(xì)胞因子抑制因子的特點(diǎn)，通過SSH 技術(shù)克隆U937 細(xì)胞被IL-10抑制的cDNA，發(fā)現(xiàn)新的趨化功能的細(xì)胞因子CKLF1。CKLF1 編碼基因定位于16q21，并且與同樣位于16號染色體長臂的CC 家族趨化因子CCL17/TARC 和CCL22/MDC 具有低水平的同源性。

CKLF1 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是CKLF1 氨基酸序列中具有一個(gè)CC 基序。馬大龍團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)CKLF1 氨基酸序列能被IL-10 抑制。他們想到CKLF1 可能是CC亞家族的一個(gè)趨化因子，但它的結(jié)構(gòu)不是典型的CC亞家族趨化因子結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究最終證明CKLF1 確實(shí)具有趨化活性，能夠?qū)Σ煌陌准?xì)胞都產(chǎn)生趨化活性，是對中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化活性更強(qiáng)。隨后馬大龍團(tuán)隊(duì)又尋找CKLF1 的受體。CKLF1 位于16 號染色體，其上游有兩個(gè)CC 家族的趨化因子CCL17/TARC 和CCL22/MDC，而這兩個(gè)趨化因子的受體都是CCR4。隨后直接檢測CKLF1 能否結(jié)合CCR4，最后發(fā)現(xiàn)CKLF1是CC 趨化因子受體4（CCR4）的功能性配體。除CKLF1 外，CCR4 還有其他幾個(gè)配體也能起作用。

2006 年，馬大龍團(tuán)隊(duì)的王應(yīng)等在Life Science 雜志發(fā)表文章提出，CCR4 是Th2 細(xì)胞的標(biāo)志之一，與速發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)。CKLF1 可促進(jìn)轉(zhuǎn)染CCR4 的HEK293 細(xì)胞受體內(nèi)化，對轉(zhuǎn)染CCR6 的細(xì)胞無作用。當(dāng)時(shí)利用CKLF1 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染CCR4 的HEK293 細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)，通過受體內(nèi)化的技術(shù)來發(fā)現(xiàn)受體和配體的相互作用。

通過一系列實(shí)驗(yàn)，證明新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子CKLF1確實(shí)是CCR4 的功能性受體。Nature Reviews 報(bào)道，Th2 細(xì)胞表達(dá)CCR4，參與哮喘發(fā)病。我們知道，CCR4是Th2 型趨化因子受體，與I 型超敏反應(yīng)相關(guān)疾病（包括變應(yīng)性鼻炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎） 有密切的關(guān)聯(lián)。

很多實(shí)驗(yàn)室對CKLF1 異常高表達(dá)的疾病研究產(chǎn)生了興趣，有的實(shí)驗(yàn)室與馬大龍教授團(tuán)隊(duì)合作開展研究，還有一些實(shí)驗(yàn)室自主開展了研究。這些研究結(jié)果顯示，CKLF1（受體為CCR4）的主要功能為趨化活性、促進(jìn)炎癥和Ⅰ型超敏反應(yīng)。CKLF1 在很多疾病中都有異常高表達(dá)的現(xiàn)象，包括炎癥性疾病和腫瘤，比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎、動(dòng)脈粥樣硬化、特發(fā)性炎性肌病、狼瘡性腎炎、ICF 綜合征、結(jié)腸腺癌、間變性星形細(xì)胞瘤、大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、大鼠腦缺血再管損傷、雄性不育突變大鼠、瘢痕疙瘩、大鼠腹主動(dòng)脈瘤。

廣州呼吸病研究所譚亞夏等在2004 年Chin Med J （Engl）報(bào)道了他們的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了CKLF1在小鼠體內(nèi)注射會引起嚴(yán)重肺部炎癥反應(yīng)。查到這篇文獻(xiàn)，馬大龍教授當(dāng)時(shí)感到十分失望，他一直進(jìn)行重組蛋白藥物研發(fā)，原本希望CKLF1 能作為重組蛋白的細(xì)胞因子藥物為臨床提供治療價(jià)值，但看到這個(gè)結(jié)果，認(rèn)識到CKLF1 作為重組蛋白藥物開發(fā)無望，但換一個(gè)思路就是尋找它的抑制劑，在臨床上可能還有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)助力發(fā)現(xiàn)CKLF1抑制劑

由此思路出發(fā)，馬大龍團(tuán)隊(duì)希望能找到CKLF1的抑制劑，意外發(fā)現(xiàn)果蠅S2 細(xì)胞表達(dá)CKLF1 的兩種分泌形式CKLF1-C19 和CKLF1-C27。這兩種分泌形式都是C 末端的兩個(gè)多肽，一個(gè)是19 個(gè)氨基酸，另一個(gè)是27 個(gè)氨基酸。通過實(shí)驗(yàn)證明，CKLF1-C19 和CKLF1-C27 均可結(jié)合CCR4，其中CKLF1-C19 是受體拮抗劑，CKLF1-C27 是激動(dòng)劑，兩者的作用正好相反。CKLF1-C19 多肽僅有19 個(gè)氨基酸，屬于小分子多肽藥物，具有非常好的抗炎作用。

馬大龍團(tuán)隊(duì)與浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院合作，開展CKLF 拮抗多臺治療小鼠哮喘模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在卵蛋白激發(fā)前30 分鐘腹腔注射C19 多肽，可明顯抑制嗜酸粒細(xì)胞在肺部浸潤，減輕哮喘肺部炎癥，并降低氣道反應(yīng)性，表現(xiàn)為跨肺壓、肺阻力的顯著下降，肺順應(yīng)性的增加。此外，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所的陳乃宏教授實(shí)驗(yàn)室開展了CKLF1-C19 抑制劑的研究，證明了C19 多肽可抑制大鼠的缺血再灌注損傷。北京朝陽醫(yī)院的研究也發(fā)現(xiàn)，C19 多肽可以抑制小鼠銀屑病的局部炎癥。

然而，C19 作為一個(gè)多肽藥物，也存在半衰期短，不能口服、只能注射等問題。為解決這些問題，馬大龍團(tuán)隊(duì)與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物和毒物研究所李松院士合作，開展CKLF1-C19 和CKLF1-C27 與CCR4 結(jié)合的虛擬藥物設(shè)計(jì)和篩選工作，合成了11 個(gè)新的化合物。馬大龍團(tuán)隊(duì)通過生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物6b 具有CCR4 拮抗劑效應(yīng)，并對小鼠鼻炎模型具有治療作用。LD50 為靜脈推注170mg/kg，口服2000mg/kg。之后又發(fā)現(xiàn)另一個(gè)效果更好的化合物8a，對小鼠哮喘模型肺部炎癥具有明顯抑制作用。

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物和毒物研究所陳乃宏教授采取了高通量藥物篩選模型的技術(shù)路線，利用CCR4轉(zhuǎn)入細(xì)胞和標(biāo)記的CKLF1-C27 多肽作為藥物篩選模型，進(jìn)行了小分子化合物的高通量藥物篩選，獲得兩個(gè)新的先導(dǎo)化合物IMMLG5521 和IMM-H004。前者對小鼠哮喘、小鼠急性和慢性炎癥、大鼠胸膜炎、大鼠肺炎等具有體內(nèi)外抗炎效應(yīng)；后者可抑制大鼠心腦缺血再灌注損傷及Okadaic acid 誘導(dǎo)的大鼠空間記憶障礙。

CKLF的臨床診斷治療應(yīng)用前景

馬大龍教授表示，他們團(tuán)隊(duì)對CKLF 的研究經(jīng)歷了從基礎(chǔ)到初步臨床應(yīng)用，可以說對CKLF 的研究前景非常光明。一是很多疾病CKLF 表達(dá)是明顯升高的，CKLF 可以作為潛在的生物標(biāo)志物，通過免疫檢測試劑進(jìn)行臨床檢測。二是CKLF 的藥物開發(fā)可以包括不同類型，包括合成多肽C19、小分子化合物D6、8a，小分子化合物IMMLG5521 和IMM-H004。三是醫(yī)科院藥物和毒物研究所也進(jìn)行了初步的治療性抗體大鼠模型研究，獲得了較好的結(jié)果。總體而言，CKLF 作為新的細(xì)胞因子，由于其在多種疾病下可發(fā)揮作用，未來在臨床上可能具有用于抗炎、抗自身免疫病或Ⅰ型超敏反應(yīng)治療的前景。

在發(fā)現(xiàn)CKLF 蛋白后，馬大龍團(tuán)隊(duì)希望能發(fā)現(xiàn)更多新的細(xì)胞因子。從發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞因子或新的人類功能基因，到最后找到具有開發(fā)價(jià)值的藥物之比約為10 ∶1。因此，必須發(fā)現(xiàn)足夠多的新細(xì)胞因子，才有可能從中挑出最具有開發(fā)前景的細(xì)胞因子。馬大龍團(tuán)隊(duì)利用計(jì)算機(jī)分析從日本的數(shù)據(jù)庫里，找到35303 個(gè)人類蛋白編碼基因，通過一系列的篩選，找到了212 個(gè)候選細(xì)胞因子基因，然后全部進(jìn)行基因克隆，122 個(gè)基因克隆成功并構(gòu)建了表達(dá)載體，然后再驗(yàn)證是否為分泌蛋白，其中36 個(gè)分泌蛋白得到了驗(yàn)證，之后又進(jìn)行大規(guī)模的免疫細(xì)胞功能篩選，最終發(fā)表文章的是發(fā)現(xiàn)10個(gè)新的細(xì)胞因子的研究。

馬大龍團(tuán)隊(duì)篩選細(xì)胞因子的設(shè)定條件主要分為5個(gè)方面：一是無免疫功能相關(guān)報(bào)道的新基因；二是存在潛在的信號肽序列或被證實(shí)為分泌蛋白，利用現(xiàn)有大量的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，以及在企業(yè)中發(fā)現(xiàn)的一些蛋白；三是一般不超過300 個(gè)蛋白氨基酸長度；四是主要在免疫系統(tǒng)或造血系統(tǒng)中表達(dá)；五是功能檢測量微小而活性強(qiáng)。如果發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子要到微克級才起作用，就放棄使用，一定要找到那些在納克級甚至納克級以下的濃度就能表現(xiàn)出生物活性的細(xì)胞因子，才將其遴選出來。

談到篩選和鑒定新細(xì)胞因子的策略，以CD4+細(xì)胞模型為例，對原代細(xì)胞先進(jìn)行體外增值、活化、分化、凋亡，挑出陽性細(xì)胞，再進(jìn)行抗體制備、受體研究，應(yīng)用體內(nèi)研究、制備轉(zhuǎn)基因鼠、基因敲除鼠等技術(shù)，迄今為止，借助高通量篩選模型的生物學(xué)策略（其中CKLF1 是利用蛋白表達(dá)譜的策略），馬大龍團(tuán)隊(duì)共發(fā)現(xiàn)11 個(gè)具有免疫功能特點(diǎn)的新細(xì)胞因子。

這11 個(gè)新細(xì)胞因子具體如下：1.CKLF1（受體為CCR4）的主要功能為趨化活性，促進(jìn)炎癥和Ⅰ型超敏反應(yīng)；潛在臨床應(yīng)用CKLF1 抑制劑用于治療哮喘、過敏性鼻炎及自身免疫病；2.OCDC134（受體為ND）的主要功能是抑制ERK 和JNK 通路，促進(jìn)CD8+細(xì)胞殺腫瘤效應(yīng)，參與細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、自身免疫病、腫瘤細(xì)胞遷移，潛在臨床應(yīng)用為重組蛋白用于腫瘤免疫治療；3.CTRP4（受體為ND）的主要功能是體外活化STAT3 和NFKB，體內(nèi)抑制小鼠食物攝入和體重，抑制小鼠腸炎模型，潛在臨床應(yīng)用是CTRP4 重組蛋白用于腸炎治療；4.VSTM1-V2（受體ND）可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和活化，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎高表達(dá)，VSTM1-V2抑制劑用于治療自身免疫病；5.CSBF/C10orf99（受體SUSD2、GPR15）可誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞G1 期阻滯和抑制細(xì)胞增殖；6.TMEM98（受體ND）可促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化，潛在臨床應(yīng)用為重組TMEM98 蛋白用于腫瘤免疫治療；7.PSMP（MSMP）可趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞（受體OCR2），參與結(jié)腸炎發(fā)病，潛在臨床應(yīng)用為PSMP抗體用于結(jié)腸炎治療；8.FAM19A4（受體FPR1）可趨化巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其吞噬活性，促進(jìn)AKT 活化；9.FAM3D（受體FPR1、FPR2）的主要功能是趨化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，參與腸道炎癥，參與腹主動(dòng)脈瘤形成，潛在臨床應(yīng)用為FAM3D 抑制劑治療腹主動(dòng)脈瘤；10.FAM19A1（受體GPR1）的主要功能是抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)其分化為神經(jīng)元，潛在臨床應(yīng)用為重組蛋白治療神經(jīng)退行性疾病；11.FAM19A5（受體SPR1）的主要功能是抑制血管平滑肌增生和移動(dòng)，同時(shí)可抑制心臟血管內(nèi)膜增生。

馬大龍教授重點(diǎn)介紹了其中幾個(gè)新的細(xì)胞因子，CTRP4（受體為ND）的主要功能是體外活化STAT3 和NFKB；體內(nèi)抑制小鼠食物攝入和體重；抑制小鼠腸炎模型；潛在臨床應(yīng)用是CTRP4 重組蛋白用于腸炎治療。

王露教授的課題組最早是在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)CTRP4 對STAT3 和NFKB 有刺激作用，還可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生。重組CTRP4 蛋白對小鼠腸炎模型具有非常好的治療作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CTRP4 可從脂肪細(xì)胞中產(chǎn)生。王露教授專門在Cell Mol Immunol雜志上寫了一篇綜述，將CTRP4 看作是脂肪細(xì)胞因子家族的一個(gè)成員，具有多樣化功能，參與了抗炎、脂肪代謝，與肥胖、抗癌作用也有關(guān)系。

邱曉彥課題組的黃晶副教授發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的細(xì)胞因子CCDC134,證明其可以促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞腫瘤免疫效應(yīng)功能，從其細(xì)胞毒性具有的活性，再通過體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)可以看到，直接用CCDC134 重組蛋白對B16 移植小鼠在體內(nèi)就有腫瘤抑制作用，但用SCID（重癥聯(lián)合免疫缺陷）鼠進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其抑制腫瘤的作用就消失了，證明CCDC134 確實(shí)是通過體內(nèi)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，對腫瘤細(xì)胞并無直接的抑制作用。

王應(yīng)教授課題組建立了趨化功能篩選平臺，對人類基因組中功能未知、具有潛在趨化因子結(jié)構(gòu)域的編碼蛋白開展了系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，并通過全套趨化因子受體表達(dá)質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定其受體，迄今利用這一技術(shù)路線已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)新的人類趨化因子及其受體。其中結(jié)合CCR2 的一個(gè)新的趨化性細(xì)胞因子PSMP,本來是從前列腺癌細(xì)胞系PC3 分泌的蛋白質(zhì)，過去不知道其功能。王應(yīng)教授課題組證明，PSMP 可以結(jié)合CCR2 在炎癥、腫瘤各個(gè)方面發(fā)揮作用，還發(fā)現(xiàn)抗PSMP 抗體3D5 在體內(nèi)具有很好的治療效果，可以治療DSS 誘導(dǎo)的小鼠腸炎，且具有明顯的抑制效果。此外，PSMP 分子還有個(gè)特點(diǎn)是人和鼠的蛋白序列完全一致，制備的鼠PSMP 單抗能直接抑制人和鼠的蛋白活性，所以用它來制備各種動(dòng)物模型都較易成功。目前，王應(yīng)團(tuán)隊(duì)也在和企業(yè)合作開發(fā)抗PSMP 抗體的藥物，希望將來能夠在臨床上得到應(yīng)用。

肥胖已成為全球性的健康問題，可以加重多種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等，但其中機(jī)制尚不明確。脂肪組織不僅是能量儲存器官,也是重要的內(nèi)分泌器官,可通過自分泌與旁分泌方式分泌多種脂肪因子，參與或調(diào)控心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。

王應(yīng)教授實(shí)驗(yàn)室與北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部孔煒教授實(shí)驗(yàn)室通力合作，通過大規(guī)模篩選發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的細(xì)胞因子FAM19A5，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析、放射性配受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、鈣流和受體內(nèi)化等一系列工作，篩選并證明了G 蛋白偶聯(lián)受體S1PR2 為FAM19A5 在血管平滑肌上的受體，與心血管疾病有非常密切的關(guān)系。血管損傷后新生內(nèi)膜的形成是動(dòng)脈粥樣硬化及血管支架術(shù)后再狹窄的重要病理過程。該研究通過建立脂肪組織特異性轉(zhuǎn)基因小鼠及血管損傷模型，發(fā)現(xiàn)脂肪組織來源的FAM19A5 可以激活血管平滑肌細(xì)胞上S1PR2 下游的G12/13-RhoA 信號通路，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖/遷移及后續(xù)血管損傷后的新生內(nèi)膜形成。研究組意外發(fā)現(xiàn)這種新的分泌蛋白FAM19A5 是一種新的脂肪因子，利用人體脂肪組織和肥胖動(dòng)物模型證實(shí)其在肥胖時(shí)表達(dá)下降。

相關(guān)文章于2018 年2 月16 日發(fā)表在《循環(huán)》（Circulation）雜志。《循環(huán)》雜志還專門為該文配發(fā)編者按文章以及FAM19A5 因子的作用模式圖，認(rèn)為脂肪因子FAM19A5 是一個(gè)肥胖相關(guān)的心血管疾病的保護(hù)因子。肥胖患者FAM19A5 因子的表達(dá)下降，容易引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，促進(jìn)了血管損傷后新生內(nèi)膜形成的進(jìn)一步增厚；而正常的表達(dá)時(shí)可以抑制血管內(nèi)膜細(xì)胞的增生。該研究揭示了介導(dǎo)脂肪-血管對話的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，為肥胖相關(guān)的心血管疾病防治提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。FAM19A5 因子未來是否有臨床應(yīng)用的價(jià)值還有待于進(jìn)一步深入的研究。

馬大龍教授說，總的來看，近年來在細(xì)胞因子研究領(lǐng)域形成了兩大高潮：第一個(gè)高潮是重組細(xì)胞因子的藥物開發(fā)；第二個(gè)高潮是細(xì)胞因子抑制劑藥物的開發(fā)。以細(xì)胞因子及其受體為靶標(biāo)的新藥開發(fā)領(lǐng)域已經(jīng)取得巨大成功，成為近年來生物醫(yī)藥新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的一個(gè)新的熱點(diǎn)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。然而，從新細(xì)胞因子到新藥開發(fā)仍有相當(dāng)遠(yuǎn)的距離，他特別希望能與臨床、企業(yè)合作，一起攻堅(jiān)克難，為我國原創(chuàng)生物醫(yī)藥產(chǎn)品的問世共同努力。

專家小傳

馬大龍，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系教授,博士生導(dǎo)師。現(xiàn)任北京大學(xué)人類疾病基因研究中心主任，中國免疫學(xué)會副理事長。在基因工程藥物、細(xì)胞因子、功能基因組學(xué)等領(lǐng)域的研究作出了突出貢獻(xiàn)，主持承擔(dān)過多項(xiàng)國家重大科技計(jì)劃課題、“863”計(jì)劃課題、國家自然科學(xué)基金課題、國家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃（973）子課題等，并完成了多種細(xì)胞因子的基因工程和蛋白質(zhì)工程研究，參加指導(dǎo)了多個(gè)新型基因工程藥物的研究與開發(fā)，取得了一系列重要成果：已申請國際專利3項(xiàng)（2 項(xiàng)美國專利授權(quán)）、多項(xiàng)國家發(fā)明專利獲得授權(quán)，主持研制2 項(xiàng)基因工程二類新藥并獲新藥證書；1 項(xiàng)基因工程一類新藥獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。發(fā)表論文及綜述130 余篇，參加著作教材編寫10 余部，2000 年主編了“863”生物技術(shù)叢書的“生物技術(shù)藥物”一書。