蠐螬提取物對實驗性兔視網膜靜脈阻塞HGF、VEGF表達的影響※

●梁凱霞 蔣鵬飛 彭 俊 彭清華,3▲

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)發病率較高，多發于50～70歲中老年人，發病率無明顯性別差異，常單眼發病，以視網膜靜脈怒張迂曲為特征，受累靜脈區域有廣泛的出血、滲出或水腫。新生血管(CNV)是RVO的常見并發癥，治療困難，嚴重影響視功能，約15%的患者并發新生血管性青光眼。

蠐螬具有破瘀、散結、止痛、解毒之功，《藥性論》言其“汁滴目中，去翳障，主血，止痛”。因此，蠐螬常用于目疾的治療。前期研究發現蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收、抑制CNV的形成[1-2]，但具體作用機制尚不明確。為進一步探討蠐螬抑制CNV的作用機制，本文觀察了蠐螬提取物對RVO模型HGF、VEGF表達的影響。

1 實驗材料

1.1實驗動物選取40只體重為1.8～2.3kg的健康實驗性兔，不限雌雄(動物許可證號：湘醫動字第30-015號)。

1.2主要實驗藥品和試劑蠐螬提取物(參考陽長明的方法[3]制備)；復方血栓通片；0.4%倍諾喜滴眼液；兔抗HGF多克隆抗體、兔抗VEGF多克隆抗體(均由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3主要實驗儀器裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺科技有限公司，型號：YZ5S)；YZZOT型顯微鏡(蘇州醫療器械設備廠)；PCR儀(德國Biometra)；Mias-2000圖形分析系統(四川川大智勝軟件股份有限公司)；Leica石蠟切片機(徠卡，型號RM2235)。

2 實驗方法

2.1動物分組采用隨機數字表法將40只實驗性兔隨機分為空白組、模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組4個組，每組均為10只動物。

2.2造模方法模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組動物應用光化學動力法[4]制作實驗性RVO模型，具體操作為：雙眼散瞳后，麻醉動物，將動物頭固定于裂隙燈前，安置三面鏡，以裂隙燈顯微鏡觀察動物眼底，激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自動物耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液(0.3mL/kg)，30s內推完，注藥后用激光照射雙側視網膜靜脈，同時注意避開伴行的動脈，遠端靜脈有明顯的擴張時即為造模成功。

2.3動物給藥方法空白組、模型組以蒸餾水5mL/kg灌胃；復方血栓通組以復方血栓通0.1g/kg溶于蒸餾水中制成混懸劑，5mL/Kg灌胃；蠐螬提取物組以蠐螬提取物0.56g/100g灌胃。每日1次，持續至動物取材。于造模后1wk、3wk每組各隨機處死5只動物取材。

2.4取材方法將實驗性兔耳緣靜脈注射空氣處死后，摘除兩只眼球，在手術顯微鏡下去除眼前節及玻璃體等多余組織，剝離激光斑部位視網膜，酒精脫水，石蠟包埋，切片，烘干備用。

2.5測試檢測將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，做免疫組化組織學檢測HGF與VEGF表達，每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個視野框，用Mias-2000圖形分析系統測量視野框內HGF與VEGF的平均光密度，在光學顯微鏡下主要觀察視網膜組織變化。

3 結果

造模后1wk：空白組視網膜各層結構清晰，排列正常，HGF與VEGF少量表達于視網膜，與模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組視網膜組織水腫，細胞排列較亂，尚無新生血管索，HGF與VEGF大量表達于視網膜，與復方血栓通組、蠐螬提取物組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；復方血栓通組、蠐螬提取物組視網膜組織水腫，細胞排列紊亂，HGF與VEGF少量表達于視網膜，兩組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。造模后3wk：空白組HGF與VEGF表達與造模后1wk時相比，差異無統計學意義(P>0.05)；模型組出現大量的新生血管索，但HGF與VEGF表達與造模后1wk時相比，差異無統計學意義(P>0.05)；復方血栓通組、蠐螬提取物組視網膜組織水腫減輕，無新生血管索，HGF與VEGF表達均較造模后1wk下降，差異有統計學意義(P<0.05)，但是兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組視網膜組織光鏡圖(HE，×400)

注：①-⑦分別表示空白組、模型組給藥后1周、模型組給藥后3周、復方血栓通組給藥后1周、復方血栓通組給藥后3周、蠐螬提取物組給藥后1周、蠐螬提取物組給藥后3周視網膜HE染色。

表1 各組HGF與VEGF陽性表達的平均光密度值

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較：◇P<0.05；與1wk時比較：▲P<0.05。

4 討論

視網膜靜脈阻塞發生后，血液回流障礙，視網膜代償性形成新生血管[5-7]，新生血管管壁僅有一層細胞構成，極易發生出血[8-9]，引起視力下降，持續的出血會對視網膜造成毒性損傷[10-11]。現代藥理研究認為蠐螬能夠治療RVO所致的視網膜病理損傷[1-2]。

視網膜靜脈阻塞屬祖國醫學“絡瘀暴盲”范疇，《銀海精微·腎經主病》認為本病病機為“屬相火上浮，水不能制。”《銀海指南·血病論》曰：“目得血而能視，血者氣之所化也。故血盛則形強，人生所賴，惟斯而已。潤經絡，澤臟腑，養筋骨，充滿一身，而目受其蔭，固宜通疏，而不宜淤滯者也。”本病的發生與血液瘀滯密切相關，而蠐螬有活血化瘀之功，切中本病病機。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)最先從肝臟部分切除的鼠血清中分離出來，而后從鼠的血小板、肝臟及人的血清中分離出來，所以命名為肝細胞生長因子[13]。在眼部，HGF可由多種細胞產生，刺激眼內多種細胞組織的生長和移行。多項研究[13-15]均說明HGF確實能介導視網膜新生血管形成。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進血管內皮細胞分裂，促進新生血管生成[16]。

本研究結果顯示：模型組HGF、VEGF表達較空白組明顯上調，復方血栓通組與蠐螬提取物組較模型組均有不同程度降低，但復方血栓通組與蠐螬提取物組相比，無統計學差異(P>0.05)，兩組的CNV產生均少于模型組，提示復方血栓通組、蠐螬提取物組是通過下調HGF、VEGF以抑制CNV的發生。本研究也存在不足之處，如未將蠐螬按劑量分為不同組別，蠐螬對HGF與VEGF的抑制作用是否與劑量有關仍不得而知。如能進行深入研究，則有望為臨床尋找療效更佳、價格更低廉的藥物，創造更大的社會效益與經濟效益。