三葉青藤葉配方顆粒急性毒性試驗(yàn)

謝 平 ，余文靜 ，陳 丹 ，洪麗婷 ，劉秀棉 ，熊朝棟 ，黃心平

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.寧化縣益珍農(nóng)業(yè)科技有限公司，福建 三明 365406）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.）為葡萄科崖爬藤屬，是我國特有的珍稀藥用植物和民間常用藥。《海南植物志》［1］及《中國植物志》［2］中記載三葉青的葉（或全株）可供藥用。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，三葉青具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，近年來在抗炎和輔助抗腫瘤方面發(fā)揮積極作用［3-4］。三葉青藤葉配方顆粒是以三葉青藤葉飲片為原料，經(jīng)水煎煮制備而成，既可隨證加減，又具有免煎易服、質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)［5］。急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)24 h內(nèi)1次或多次給藥后動(dòng)物表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)，通過測(cè)定半數(shù)致死量觀察動(dòng)物急性毒性中毒表現(xiàn)［6-9］。為評(píng)價(jià)三葉青藤葉配方顆粒用藥的安全性，實(shí)驗(yàn)依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［9］，采用最大耐受量（MTD）試驗(yàn)法，通過最大給藥濃度及最大小鼠灌胃體積給藥，觀察小鼠的急性毒性反應(yīng)，初步評(píng)價(jià)三葉青藤葉配方顆粒的口服用藥安全性，為三葉青藤葉配方顆粒的安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量21～25 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，環(huán)境濕度（55±5）%，保持室內(nèi)自然通風(fēng)，自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)前置于飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)7 d。SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)SYXK（閩）2014-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 試藥 三葉青藤葉（寧化縣益珍農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定）；三葉青藤葉配方顆粒（自制，批號(hào)20160416）；0.9%氯化鈉注射液（福州海王福藥制藥有限公司，批號(hào)60929A45）。

1.3 儀器 ARA520百分之一電子天平、AR2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液的配制 稱取三葉青藤葉配方顆粒，加25 mL蒸餾水配制成濃稠混懸液，并以灌胃針測(cè)試至可吸取的濃稠度，即得三葉青藤葉配方顆粒的最大給藥濃度藥液（0.76 g／mL）。

2.2 小鼠急性毒性LD50預(yù)實(shí)驗(yàn) 取昆明小鼠40只，體質(zhì)量21～24 g，雌雄各半，分為2組，實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)3 d后，給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥三葉青藤葉配方顆粒藥液1次（30.4 g／kg），連續(xù)觀察7 d，擬找出100%死亡率，進(jìn)行Dm值的測(cè)定。

2.3 急性毒性最大耐受量法試驗(yàn) 取昆明小鼠40只，體質(zhì)量22～25 g，雌雄各半，雌雄小鼠分開后，分別隨機(jī)分為給藥組和空白組，每組各20只，給藥前禁食不禁水12 h。以40 g／kg蒸餾水灌胃空白組1次，以30.4 g／kg三葉青藤葉配方顆粒藥液灌胃給藥組1次。給藥后密切觀察6 h內(nèi)2組小鼠狀況，連續(xù)觀察14 d，每天1次，觀察記錄小鼠外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、攝食、飲水、排泄情況、是否有中毒癥狀及死亡情況，同時(shí)稱量給藥前和給藥后第1、2、3、4、5、7、9、11、14 天體質(zhì)量，記錄體質(zhì)量變化。若有小鼠死亡，立刻將死亡小鼠解剖，肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器。第14天處死各組小鼠，對(duì)其主要臟器進(jìn)行肉眼觀察比較，若發(fā)現(xiàn)肉眼可見病變，則進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查，同時(shí)稱取各臟器濕重，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 檢測(cè)指標(biāo) 計(jì)算2組小鼠給藥后14 d內(nèi)累計(jì)死亡數(shù)；記錄給藥組小鼠急性毒性反應(yīng)（皮毛、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等系統(tǒng)反應(yīng)癥狀及自發(fā)活動(dòng)變化癥狀）；2組小鼠體質(zhì)量變化；2組小鼠臟器指數(shù)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 2組小鼠急性毒性LD50預(yù)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，2組小鼠狀況良好，無死亡，無法測(cè)出LD50，故選擇最大耐受量（MTD）法實(shí)驗(yàn)。

3.2 給藥組小鼠給藥后癥狀觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥后10～15 min，給藥組小鼠行動(dòng)減緩，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍；25～30 min后，開始逐漸恢復(fù)正常活動(dòng)及飲食飲水，在鼠籠內(nèi)攀爬，觀察期內(nèi)無動(dòng)物死亡，2組小鼠均未出現(xiàn)其他急性毒性反應(yīng)癥狀。小鼠急性毒性反應(yīng)癥狀譜，見表1。

表1 小鼠急性毒性反應(yīng)癥狀譜

3.3 小鼠急性毒性MTD值測(cè)定 根據(jù)三葉青藤葉配方顆粒的小鼠灌胃給藥量，且最大耐受量（MTD）法實(shí)驗(yàn)過程中，2組均未出現(xiàn)小鼠死亡情況。因此，最大耐受劑量大于最大給藥量 30.4 g／（kg·d）（0.76 g／mL×0.4 mL／10 g×1 次），根據(jù)三葉青成人民間服用量15 g／d計(jì)算，相當(dāng)于是臨床按60 kg體重計(jì)算每公斤體質(zhì)量日用量的121.6倍以上。

3.4 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較 給藥后第14天，脫頸處死2組小鼠，解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎，稱取各臟器濕重，計(jì)算臟器指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，給藥組的小鼠各臟器的顏色、質(zhì)地?zé)o明顯差異，臟器指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表 2。

表2 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較（）

表2 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較（）

腎10.21±1.49 13.90±1.00 9.59±0.83 9.66±0.65心4.08±0.27 4.11±0.46 3.85±0.59 4.01±0.65肝40.33±5.19 41.10±2.12 38.76±3.31 41.32±2.16脾1.98±0.14 2.51±0.41 2.04±0.23 2.45±0.65肺5.77±1.05 6.08±0.80 5.93±0.66 5.91±1.48組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性胸腺2.61±0.09 2.30±0.44 2.69±0.52 2.40±0.23

3.5 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較 稱量給藥前和給藥后第 1、2、3、4、5、7、9、11、14 天體質(zhì)量，記錄體質(zhì)量變化。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，2組雌、雄小鼠各時(shí)間組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較（）g

表3 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較（）g

第4天27.30±1.67 27.20±1.26 27.60±1.22 27.60±1.41給藥前22.67±0.94 22.70±0.07 22.00±0.94 22.40±1.16第1天24.30±1.06 24.50±1.72 24.00±0.79 24.50±1.33第2天25.40±0.24 25.90±1.88 25.80±1.39 25.50±1.50第3天26.90±1.88 26.30±1.75 26.90±1.33 26.80±1.10組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性第5天28.10±1.64 28.60±0.59 28.70±1.41 28.50±0.89第11天31.90±1.56 34.20±0.81 31.50±1.32 34.60±1.76第7天29.00±0.13 31.60±0.50 29.20±0.81 32.90±1.00第9天30.70±1.63 33.00±1.40 30.60±0.78 33.60±1.37第14天32.70±1.54 35.00±1.26 32.80±1.15 35.60±0.78組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性給藥后給藥后

4 討 論

實(shí)驗(yàn)研究證明，三葉青藤葉配方顆粒具有良好的抗炎作用［10］。經(jīng)初步安全性預(yù)實(shí)驗(yàn)，以最大給藥濃度、最大給藥體積小鼠1次口服灌胃，無Dm值（100%死亡率），故選擇MTD試驗(yàn)法進(jìn)行三葉青藤葉配方顆粒急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，計(jì)算小鼠最大耐受藥量倍數(shù)，以耐受人臨床用量的100倍以上為安全，根據(jù)三葉青成人民間服用量15 g／d計(jì)算，小鼠最大耐受藥量是臨床用量的121.6倍以上，提示三葉青藤葉配方顆粒毒性低，口服用藥安全。