電針內關穴對缺氧誘導心肌損傷SD大鼠HIF-1α及VEGF的影響

修春英 ，陳 白 ，趙莉莉 ，汪 欣

（1.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州350003；2.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州350003）

心血管疾病的發生是多種不良因素長期相互作用的結果，已成為危害人類健康、導致疾病和死亡的一個主要原因，而缺氧誘導的心肌損傷是心血管疾病的主要致病因素之一［1］。前期研究表明，針刺手厥陰心包經穴位對急性缺氧下心功能損傷具有調節作用［2］，而 缺氧誘導因 子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是機體缺氧反應中的關鍵作用因子。由此推測，手厥陰心包經的針刺效應可能與調控HIF-1α、VEGF相關。在此基礎上，本研究通過建立大鼠慢性缺氧模型，觀察針刺心包經內關穴對HIF-1α、VEGF的影響，從而探討其療效機制，現將結果報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 SD大鼠60只，體質量160～200 g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（閩）2012-0001。隨機分為正常對照組、模型組、內關組，每組20只。

1.2 主要儀器與試劑 低氧混合氣體（12%O2，88%N2，福州中銘工業氣體有限公司）；Trizol Reagent（美國 Invitrogen 公司）；SYBY Premix Ex TaqTM、Prime-Script逆轉錄試劑盒（日本TakaRa公司）；大鼠VEGF定量酶聯檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALLEGRA 64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；CODA型全自動酶免分析儀（美國Bio-Rad公司）；WQ-10D1型多用電子穴位測定治療儀（北京市海淀東華電子儀器廠）；1寸華佗牌一次性使用無菌針灸針 （蘇州醫療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 參照文獻［3］的造模方法，將模型組和內關組大鼠置于低氧艙內，持續通入低氧混合氣體（12%O2，88%N2）12 h，隨后通入空氣 12 h，連續12 d；對照組在相同的艙體內通入空氣。低氧艙內壓強、溫度和濕度保持一致，CO2濃度維持在0～0.8%范圍內。

2.2 電針參數 建立模型后內關組進行電針內關穴干預，每日1次，每次30 min，連續5 d。疏密波，刺激頻率10／20 Hz，強度以肢體出現輕微顫動為度［4-5］。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 實時定量 PCR法檢測 HIF-1α、VEGF的mRNA表達 ① 采用Trizol法抽提大鼠心肌組織的總RNA，通過OD260／OD280值進行 RNA純度及含量的測定。取2 μg總RNA進行逆轉錄反應。引物序列如下：HIF-1α：上游引物5'-CAAAACACACAG CGAAGC-3'，下游引物 5'-TCAACCCAGACATATCC ACC-3'，擴增產物長度 473 bp；VEGF：上游引物5'-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3'，下游引物 5'-ACTC CAGACCTTCGTCGTTG-3'，擴增產物長度 240 bp；βactin：上游引物 5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'，下游引物5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'，擴增產物長度156 bp。② 去除基因組DNA：用DNase I消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。RNA純化及質量檢測：用RNA純化試劑盒純化RNA，紫外吸收測定法測RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。③cDNA合成：逆轉錄試劑盒合成cDNA。④ 實時定量PCR：將配好的混合液加到PCR Array對應的每個孔中，然后置PCR Array于實時定量PCR儀進行PCR反應。反應條件：94℃預變性5 min后，94℃變性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環后 72℃維持5 min。數據分析：采用ΔΔCt方法，先計算每個樣本的 ΔCt，ΔΔCt＝ΔCt（組別）－ΔCt（正常對照組），最后通過2-ΔΔCt計算各組別與對照組對應基因的表達差異。

2.3.2 ELISA法檢測VEGF蛋白的含量 將心肌組織按1∶6加入勻漿緩沖液研磨成組織勻漿，10 000 r／min離心10 min，取上清，勻漿液置-20℃冰箱貯存備用。檢測方法按試劑說明書進行，用全自動酶免分析儀測定結果，檢測波長為450 nm。

2.4 統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（）表示，采用單因素方差分析，在方差齊性的情況下，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊情況下用Dunnett’s T3檢驗。

3 結 果

3.1 3組大鼠 HIF-1α、VEGF的 mRNA表達變化比較 見表1。

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達變化比較（）

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達變化比較（）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組模型組內關組n 20 20 20 HIF-1α 1 1.81±0.541）3.41±0.321）2）VEGF 1 2.17±0.811）3.50±0.171）2）

3.2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較 見表2。

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組模型組內關組n 20 20 20 VEGF／（μg／L）1.80±0.19 2.25±0.271）2.61±0.251）2）

4 討 論

缺氧是臨床常見的病理類型，不僅見于傳統的高原環境缺氧，隨著現代生活方式的改變，生活中有氧運動不足再加上環境污染，人類已不知不覺處在慢性缺氧的環境中。研究表明，缺氧誘導的氧化應激反應與高血壓病、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病等多種心血管疾病密切相關，并導致心臟受累而引發缺血性心臟病、肺源性心臟病和貧血性心臟病［6-7］。HIF-1α是目前發現具唯一特異在低氧狀態下發揮活性的轉錄因子，在缺氧誘導基因的表達調節過程中起關鍵作用［8］。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有增加血管通透性及促進血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成的作用。HIF-1α能使VEGF的轉錄和表達增強，增加血管生成，使血液到達缺氧部位，從而降低因缺氧帶給機體的損傷［9］。

基于缺氧在心血管疾病過程的重要性，慢性缺氧模型成為模擬心血管疾病的常用動物模型。本研究通過持續通入低氧混合氣體的方法制備慢性缺氧的模型，結果顯示在慢性缺氧的環境中，大鼠心肌組織的HIF-1α、VEGF的mRNA的表達增加，同時VEGF的蛋白含量增加，證實了慢性缺氧下心肌組織的應激反應。

《靈樞·經脈》曰：“心主手厥陰心包絡之脈，起于胸中，出屬心包絡。”經脈所過，主治所及，研究證實，針刺手厥陰心包經穴位具有良好的心肌保護效應［10］。前期研究顯示，循手厥陰心包經取穴，電針內關穴、天泉穴對缺氧狀態下的心功能具有良好的調節作用［2，11］。 鑒于以上的相關研究和前期研究，本研究選取內關穴作為研究手厥陰心包經的代表穴位。內關穴作為手厥陰心包經的絡穴、八脈交會穴，是臨床手厥陰心包經治療心血管疾病最常用、最具代表意義的穴位。本研究結果顯示，針刺內關穴能增加HIF-1α、VEGF的mRNA表達，同時心肌組織的VEGF蛋白含量也明顯升高，表明內關穴可以通過調節對HIF-1α、VEGF的mRNA的表達，從而增加血管生成，提高機體對缺氧的耐受性，對缺氧誘導的心肌損傷具有保護作用。

綜上所述，針刺手厥陰心包經內關穴具有對抗缺氧誘導心肌損傷的作用，其作用機制可能與介導HIF-1α、VEGF的調控相關，從而為臨床應用手厥陰心包經防治心肌缺氧所致疾病提供部分理論依據。