豬毛菜屬3種不同光合型物種的生長適應特征比較

周文菲,劉芙蓉,姚甄業,龔春梅

(西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌712100)

干旱缺水是中國西北荒漠地區尤為突出的生態問題[1]，也是影響植物生長發育和限制植物分布的重要因素[2]。植物光合作用對環境因子的變化高度敏感，因此植物受到干旱脅迫時表現出由氣孔限制或非氣孔限制包括光合結構發生變化、光合關鍵酶等活性下降所致[3]的凈光合速率下降[4]。此時C3植物會通過關閉氣孔的方式來保持植物體內的水分，導致細胞內CO2吸收受阻，促進核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase, Rubisco)與氧氣結合，使光呼吸加強，而這一提高光呼吸或者降低CO2濃度的氣孔限制會誘導C4光合的出現[5]。C4植物更適應水分脅迫和高溫等逆境[6]而獲得比C3植物更高的光合速率[7]。看來干旱引起的氣孔和非氣孔限制促進了C4光合的發生，是C4途徑進化的外部動力和環境因素。隨著解剖結構和酶活生理研究的深入，越來越多的證據表明隨干旱加劇首先要求解剖結構發生更利于C4光合進行的變化[8-11]，隨后C4關鍵酶活性相應增強。C3植物發展出的C4途徑是環境調控的產物，是對逆境的適應性進化結果，研究干旱地區植被的光合途徑演化有利于對干旱地區植被的適應性機理進行深入剖析[12]。

C3、C3-C4和C4植物的生長適應性是光合途徑進化的直觀表現，因而對光合適應性的研究開始受到關注，樸河春等[13-14]對C3和C4植物的土壤的營養元素進行探究，陳宇琪等[15]對C3和C4植物種子的出苗和幼苗的生長等進行研究，王玉魁[16]對不同光合型物種的抗旱生理進行研究，但這些研究還不夠全面系統深入。對干旱地區具有不同光合型的同屬物種進行生長適應性研究非常有必要，這為完善C4光合進化理論提供了生理生態特征變化證據。豬毛菜屬(Salsola)是藜科(Chenopodiaceae)中較為進化的螺胚亞科中的豬毛菜族，是該族中的原始屬[17]。目前對豬毛菜屬植物在種子生理、養分條件、光合指標等多個方面進行了環境適應性研究[18-21]，包括對適應鹽堿生境的先鋒植物費爾干豬毛菜(Salsolaferganica)等的經濟和生態價值研究[22]。當前國內外研究進展和本實驗室的研究結果發現豬毛菜屬植物中存在著不同的光合型[23-26]，如蒿葉豬毛菜(S.abrotanoides)和天山豬毛菜(S.junatovii)為C3光合型，松葉豬毛菜(S.laricifolia)和白枝豬毛菜(S.arbusculiformis)為C3-C4中間光合型，木本豬毛菜(S.arbuscula)和東方豬毛菜(S.orientalis)為C4光合型，這些植物多生活在干旱荒漠及鹽堿土地區，逐漸形成了適應干旱的形態特征和生理機制。因此豬毛菜屬植物為研究不同光合型荒漠植物適應干旱環境的策略提供了理想材料，對促進荒漠植被恢復、改善生態環境具有重要的生態價值和社會價值。鑒于對荒漠生境不同光合型植物的抗逆生長適應特征還缺乏更全面深入的比較研究，而結合C4進化對豬毛菜屬植物進行生長適應性的研究有必要進一步完善。

本研究利用DNA條形碼技術構建系統進化樹，選擇豬毛菜屬具有各自地理分布的3種不同光合型木本類豬毛菜(C3蒿葉豬毛菜、C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜)作為研究對象，測定其葉和種子形態結構特征、土壤和植物營養(C、N、P)、干旱響應指標[丙二醛(malondialdehyde,MDA)、可溶性糖(soluble sugar)、脯氨酸(proline)]，并進行主成分分析，通過比較不同光合型植物在各自生境干旱脅迫下的生理響應，以期為更好理解C4進化提供生理生態數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以2016年采集的西北荒漠廣泛分布的C3型蒿葉豬毛菜、C3-C4中間型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜為研究對象，采集上述豬毛菜鮮葉樣品液氮速凍帶回至實驗室-80 ℃保存進行生理生態相關指標測定。采樣同時收集的3個物種所在的自然保護區生境概況如表1所示，隨著光合型從C3經由C3-C4向C4過渡3個物種的生境年降水量依次減少，干旱程度加劇。

表1 豬毛菜屬C3、C3-C4和C4光合型物種采集地的生境概況Table 1 The habitat profile of the C3, C3-C4 and C4 species of Salsola genus

1.2 試驗方法

條形碼基因rps16-trnQ參考Schussler等[26]的方法進行測定，采用SDS(sodium dodecyl sulfate)法提取植物DNA，參考Schussler等[26]的方法設計條形碼基因rps16-trnQ的引物并進行PCR反應，送至擎科新業生物技術有限公司測序獲得序列，結合NCBI(national center for biotechnology information)下載序列，并利用Mega構建NJ(neighbor-joining)進化樹,采用戊二醛固定液對葉片解剖結構固定后用半薄切片機進行切片分析[26]，采用體式顯微鏡(Nikon SMZ 25)進行拍照獲得種子形態，種子重量在萬分之一天平上進行測定。

采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[27]，稱取0.1 g植物樣品，加入20%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)研磨沖洗并定容至2.5 mL，離心后取上清液放入離心管，再加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)，混勻后在100 ℃水浴煮10 min，離心后取上清液測定450、532和600 nm處的吸光值；采用蒽酮法測定可溶性糖含量[28]，稱取0.1 g植物樣品，定容到7 mL水中，吸取200 μL提取液，加入800 μL蒸餾水和5 mL蒽酮試劑，在沸水浴中煮沸10 min，620 nm處測定吸光度值；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[27]，稱取0.1 g植物樣品，用3 mL磺基水楊酸溶液，在沸水中提取10 min，吸取2 mL提取液，加入2 mL 冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，在沸水浴中加熱30 min，冷卻后加入4 mL 甲苯，搖蕩30 s，取上清液至10 mL離心管中，520 nm處測吸光度值。

土壤樣品過0.180 mm篩子、植物葉片過0.250 mm篩子，以備用于對碳氮磷含量的分析。采用重鉻酸鉀外加熱法測定葉片和土壤有機碳含量[29]，稱取0.02 g左右的葉樣和0.5 g左右的土樣進行測定；采用半微量凱氏定氮法測定葉片和土壤全氮含量[30]，稱取0.2 g左右的葉樣和1 g左右的土樣消煮后測定；采用鉬銻抗比色法測定葉片和土壤全磷含量[31]，稱取0.2 g左右的葉樣和0.7 g左右的土樣消煮后進行測定。

1.3 數據分析

利用MEGA 7軟件構建系統發育進化樹，利用ImageJ2x計算葉片和種子的直徑和面積等指標，土壤碳氮磷比值通過土壤養分測定的數據計算化學計量比。采用GraphPad Prism 5對數據進行分析和作圖，利用SPSS 17.0和RStuido軟件進行主成分分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 基于DNA條形碼的豬毛菜屬種系統發育樹構建

DNA條形碼技術是利用一段具有足夠變異的標準化短基因對物種進行鑒定[32]，分子系統發育進化樹是通過比較生物分子序列間的關系而建立的，可以表示各個物種間的進化關系。植物DNA條形碼技術有多種可供選擇的基因，本研究利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和試驗獲得的rps16-trnQ序列構建系統發育樹，結果顯示C3蒿葉豬毛菜為原始祖先，繼而分別進化出C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜(圖1)。為豬毛菜屬不同光合型植物的進化方向和親緣關系提供可靠證據。

圖1 基于rps16-trnQ構建的豬毛菜屬不同光合型物種的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide of rps16-trnQ

2.2 豬毛菜屬3種光合型物種形態結構適應性比較

2.2.1葉片解剖結構的比較 豬毛菜屬植物葉片多呈圓柱形，因而可對葉片直徑進行測量從而反映葉片大小(圖2a～c)。C4東方豬毛菜的葉片直徑顯著低于C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜的葉片直徑相較于C3蒿葉豬毛菜有變小的趨勢(圖2d)。C3型豬毛菜葉片橫切面的最外層為表皮細胞，葉肉細胞居于中間，向內是發達的貯水薄壁組織細胞，維管束分布在貯水組織中，中央的維管束較大，維管束鞘不發達；C3-C4松葉豬毛菜與C3蒿葉豬毛菜相比，其葉肉細胞的面積無顯著差異，但有減少的趨勢，出現具備部分功能的不完全花環結構區域，即由葉肉細胞和不連續的維管束鞘細胞組成(圖2e)；C4型豬毛菜具有由葉肉細胞和維管束鞘細胞組成的典型C4“花環結構”。另外，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物具有較大的貯水組織，且C4植物的貯水組織面積大于C3-C4植物(圖2f)；C3-C4植物和C4植物的柵欄組織更為發達。

2.2.2種子形態結構的變化 豬毛菜屬3種光合型豬毛菜種子均為螺旋胚形(圖3a～i)，不同點在于種子外層覆蓋物和種子大小，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物種子外層覆蓋物更為緊密；C3-C4植物的種子大小和重量都明顯大于C3植物和C4植物(圖3j,k)。圖3a～c分別顯示C3型蒿葉豬毛菜的上下兩面和剝去覆蓋物后的種子形態；圖3d～f分別顯示C3-C4植物松葉豬毛菜的上下兩面和剝去覆蓋物后的種子形態；圖3g～i分別顯示C4植物東方豬毛菜的上下兩面以及剝去覆蓋物后的種子形態。

2.3 豬毛菜屬3種光合型物種生理水平適應性比較

C4型東方豬毛菜的丙二醛含量略高于C3-C4型松葉豬毛菜，但都明顯低于C3型蒿葉豬毛菜，說明C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜在干旱環境下的膜穩定性都較高(圖4a)；C3-C4型松葉豬毛菜的可溶性糖含量低于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜(圖4b)；隨著光合型向C4轉變，脯氨酸含量呈現逐漸下降的趨勢(圖4c)。推測可溶性糖在C4東方豬毛菜的滲透調節中起重要作用，脯氨酸在C3-C4松葉豬毛菜滲透調節中起一定作用，而可溶性糖和脯氨酸在C3型蒿葉豬毛菜通過滲透調節的抗旱適應性中均起一定作用。

2.4 豬毛菜屬3種光合型物種生境貧瘠適應性比較

2.4.1植物葉生態化學計量特征 C3-C4松葉豬毛菜的碳含量低于C3蒿葉豬毛菜，但二者都遠遠低于C4東方豬毛菜(圖5a)；C3植物的氮含量顯著高于C3-C4植物，但是兩者都顯著低于C4植物(圖5b)，這與磷含量在3種光合型豬毛菜中的趨勢類似(圖5c)。C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的C/N和C/P無顯著差異，但是都顯著低于C3-C4松葉豬毛菜(圖5d,e)；這說明C3-C4松葉豬毛菜的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的碳含量最高。再結合3種光合型植物的碳含量發現不同光合型豬毛菜采用不同策略來增強固碳量，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強N、P元素的利用率來增加植物的固碳量，而C4東方豬毛菜通過增加N、P元素的含量來增加植物的固碳量。從C3到C3-C4再到C4豬毛菜，葉N/P呈現下降趨勢(圖5f)，表明這3種光合型豬毛菜體內P起限制作用，到C4東方豬毛菜，這種限制作用逐漸減小，暗示C4進化過程中低磷脅迫越來越弱。同時N/P下降也反映出植物可以降低對氮的需求，以便更能適應貧瘠的環境從而提高耐瘠薄性。

圖2 豬毛菜屬3種不同光合型物種的葉片解剖結構特征比較Fig.2 The leaf anatomical structure and relative quantitative index of Salsola genus 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences (P<0.05). The same below.

圖3 豬毛菜屬不同光合型物種的種子形態差異以及直徑和百粒重的比較Fig.3 The variation of seeds morphology, 100-seed weight and diameter among 3 photosynthetic types of Salsola genus

2.4.2土壤生態化學計量特征 C3蒿葉豬毛菜生境中的土壤碳、氮含量顯著高于C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6a,b)，說明C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營養元素相對匱乏。C3-C4松葉豬毛菜生境中的土壤磷含量顯著高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6c)。C3-C4松葉豬毛菜的土壤C/N略高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但不顯著，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間的C/N差異不大(圖6d)，有效氮含量略低于全國平均水平。C4東方豬毛菜的土壤C/P和土壤N/P略高于C3-C4松葉豬毛菜，但是它們的土壤C/P和土壤N/P都顯著低于C3蒿葉豬毛菜(圖6e,f)，豬毛菜生境土壤C/P含量明顯低于全國平均水平，且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷含量遠遠大于C3蒿葉豬毛菜。

圖4 豬毛菜屬不同光合型物種的抗旱性差異比較分析Fig.4 The physiological index among the 3 photosynthetic types of Salsola genus

圖5 豬毛菜屬不同光合型物種葉營養元素及比值變化Fig.5 The content of leaf nutrient elements and its ratio of Salsola genus

2.5 主成分分析

逆境下植物的生長適應性由多種生理生態指標共同塑造，而這些指標之間具有一定的相關性，為探究這些相關指標對豬毛菜適旱生長的貢獻率，本試驗采用主成分分析法，對干旱驅動的不同光合型豬毛菜的各項指標進行綜合分析，為C4進化的表觀生長影響因子進行歸類并評價。

通過主成分分析，提取2個主成分，在第一主成分軸上，C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜得分較高。在第二主成分軸上，C3植物蒿葉豬毛菜得分較高(圖7)。第一主成分的方差貢獻率為51.079%，在這一主成分中，葉片C、N、P含量和葉片C/N、C/P、種子直徑和百粒重、可溶性糖含量和土壤C/N、土壤P含量等指標具有較高的載荷值，對松葉豬毛菜貢獻較大(表2和圖7)；第二主成分的方差貢獻率為48.921%，這一主成分中，葉片C、N和P以及貯水組織面積、維管束鞘面積、可溶性糖含量、降水量等具有較高的載荷值，對東方豬毛菜貢獻較大(表2)。

圖6 豬毛菜屬不同光合型物種生境土壤營養元素及比值變化Fig.6 The content of soil nutrient elements and its ratio among 3 photosynthetic types of Salsola genus

項目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2項目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2葉片C/PLeafC/P0.998-脯氨酸含量Prolinecontent0.2620.965土壤P含量SoilPcontent0.990-0.140降水量Precipitation0.2760.961葉片C/NLeafC/N0.988-0.156土壤C含量SoilCcontent-0.3120.950種子百粒重100-seedsweight0.978-0.210土壤N含量SoilNcontent-0.3500.937葉片N含量LeafNcontent-0.966-0.258維管束鞘面積Areaofbundle-sheathcell-0.436-0.900種子直徑Seeddiameter0.964-0.268土壤C/PSoilC/P-0.5060.863可溶性糖含量Solublesugarcontent-0.942-0.334土壤N/PSoilN/P-0.5060.862葉片P含量LeafPcontent-0.906-0.423葉片直徑Leafdiameter0.5090.861土壤C/NSoilC/N0.865-0.502MDA含量MDAcontent-0.6890.724葉片C含量LeafCcontent-0.828-0.561貢獻率Contributionrate(%)51.07948.921葉片N/PLeafN/P-1.000累積貢獻率Cumulativecontributionrate(%)51.079100.000貯水組織面積Areaofwaterstoragecell-0.112-0.994

從載荷圖(圖7)可知，在第一主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3蒿葉豬毛菜的土壤C、N含量和土壤N/P、C/P、丙二醛和脯氨酸含量較高；C3-C4松葉豬毛菜的種子直徑和百粒重、葉片C/N、C/P較高；C4東方豬毛菜的維管束鞘面積和貯水組織面積、葉片C、N、P含量、可溶性糖含量較高。

圖7 豬毛菜屬不同光合型物種多種指標的載荷圖Fig.7 Load map of various indexes among 3 photosynthetic types Salsola genus

3 討論

至此，已對藜科豬毛菜屬3種不同光合型植物應對干旱貧瘠的生長適應性做了初步比較。

首先確立不同光合型豬毛菜的親緣關系和C4演化方向。已有研究對菊科黃頂菊屬(Flaveria)不同光合型植物的關系進行研究，發現黃頂菊屬C3植物位于系統發育樹的最底部，之后進化出C3-C4和C4光合途徑[33]。本研究利用DNA條形碼對不同光合型豬毛菜植物進行構樹聚類研究，發現C3-C4型豬毛菜與C4型豬毛菜也是由C3型豬毛菜演化而來，這與不同光合型黃頂菊屬植物的進化總體方向一致[34]，明確了不同光合型豬毛菜的親緣關系和C4進化方向。

不同光合型豬毛菜應對干旱脅迫產生葉和種子的形態結構不同。葉片可以進行光合作用和蒸騰作用等多種生命活動，在植物生長過程中發揮重要作用，在行使生理功能的過程中葉片與環境之間有著緊密的關系，因而為了適應環境的變化，植物葉片會在外部形態、解剖結構等多個方面發生一系列的適應性變化。豬毛菜屬3個種從C3向C4方向過渡，外部形態上柱狀葉趨于細短，細小的葉型可以減少水分蒸發面積而更耐旱[4]，表明豬毛菜屬植物在向C4進化過程中其葉片外部形態越來越適應干旱環境。解剖結構上相較于C3種，C3-C4種和C4種的柵欄組織和貯水組織更為發達。柵欄組織/海綿組織越大，即柵欄組織越發達，植物越耐旱；貯水組織越發達，植物越耐旱[35-36]。這便是豬毛菜C4植物更耐旱的原因[37]。同時豬毛菜C4種葉片具有典型的豬毛菜型“花環”結構，即由外層整齊排列的葉肉細胞和內層較發達的維管束鞘細胞組成，旨在通過四碳化合物從葉肉細胞向維管束鞘的運輸實現二氧化碳在維管束鞘細胞內的再固定，為高光效光合作用提供了快速產生和運輸有機產物的物質條件和合理結構。

干旱條件下植物的生長環境非常嚴酷，因此，為適應這種嚴酷的條件，植物具有其特殊的適應機制，其中種子繁殖便是荒漠植物產生的一種適應機制[38]。從種子自身萌發特性而言，種子大小影響植物生長和存活：較大的種子萌發緩慢但萌發后生存力強，自身競爭力強；較小種子萌發較快但萌發后生存力較弱，但種子大小與種子數量和種子擴散分布成反比，具有較小種子的植物，其種子在數量上一般居多，采取的是機會主義生存策略[39]。C3-C4松葉豬毛菜的種子無論在形態上還是重量上都明顯大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，其采用增強種子自身競爭力的機制來適應環境，而C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜則采取在種子傳播上占據優勢的策略。為了適應干旱的環境，荒漠植物種子表面具有水溶性抑制物質，只有在大量降水后，這些抑制物質被洗脫掉才能萌發，以保證形成的幼苗不致因缺水而枯死。從形態上可以看出來，豬毛菜種子外有一層覆蓋物，這層覆蓋物可能發揮著保護種子免受環境脅迫、保持種子水分等作用，隨著向C4進化，這層覆蓋物越加致密發達。

干旱脅迫下植物細胞膜容易發生過氧化反應產生丙二醛，因此常用葉片的丙二醛含量來反映植物膜脂過氧化程度，即丙二醛含量越高，說明細胞膜不穩定，則植物的抗旱能力越弱。不同光合型豬毛菜應對干旱脅迫在抗性生理方面表現出差異。干旱脅迫下植物葉片容易遭受氧化脅迫使得膜脂過氧化產生丙二醛，但耐旱植物在逆境中產生的丙二醛含量較低[40]，本試驗中C4物種產生的丙二醛含量較低。干旱脅迫下，植物細胞內水勢較低，會通過積累滲透調節物質來吸收更多的水分以維持植物體正常的生命活動，這些滲透調節物質主要有可溶性糖和脯氨酸等。本研究結果中，脯氨酸和可溶性糖在C3蒿葉豬毛菜中的作用均大于C3-C4蒿葉豬毛菜，相較于脯氨酸，可溶性糖在C4東方豬毛菜中發揮重要的作用。不同植物在干旱脅迫下積累的滲透調節物質種類存在差異，如無機離子在中生植物滲透調節中起的作用較小[41]，但在葡萄(Vitisvinifer)植株中卻起著大于可溶性有機物質的作用[42]。可溶性糖含量在甜菜(Betavulgaris)[43]、豌豆(Pisumsativum)[44]等植物抗旱中發揮著重要的滲透調節作用，但是也有研究指出干旱脅迫下，植物碳同化率降低，可溶性糖含量降低[45]，本試驗中相較于脯氨酸，可溶性糖在調節C4東方豬毛菜滲透作用的過程中起著更為重要的作用，在向C4光合過渡中植物的光合能力逐漸增強，通過可溶性糖來調節植物體內的滲透勢具有極為便利的物質基礎。

植物通過光合作用吸收大氣中的二氧化碳，通過葉的蒸騰作用獲取土壤中的水分和礦質營養元素，驅動陸地生態系統中水和碳氮磷等元素的生物地化循環[46]。作為植物的基本營養元素，C元素是構成植物體最主要的結構元素，而N和P是植物體主要的功能元素，因為它們是植物體內各種蛋白質和遺傳物質重要的組成元素，C、N、P在植物生長和各種生理調節機能中關系密切,且發揮著重要作用。植物葉片中的C/N、C/P不僅可以反映植物N、P元素的利用率，還反映了植物吸收單元同化C元素的能力。換言之，比值越高，說明植物吸收單位N或者P元素同化的C元素越多[47-48]，植物N/P則被用來評價生態系統中營養元素的限制作用。本試驗結果中，C3-C4植物的C/N、C/P中明顯大于C3植物和C4植物，這說明C3-C4植物的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的C含量最高，再結合3種光合型植物的碳含量發現不同光合型豬毛菜采用不同策略來增強碳積累，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強N、P元素的利用率來增加植物的碳積累，而C4東方豬毛菜通過增加N、P元素的含量來增加植物的碳積累。植物組織中的營養元素含量被用來評價生態系統中營養元素限制作用，N/P的化學計量比值被用來評價N或P中哪一種更多地起限制生物量產量和物種豐度的作用，一般認為，N起限制作用的N/P臨界值為6.7～16.0，而P起限制作用的N/P臨界值為12.5～26.3，低于臨界值表示N起限制作用，高于臨界值表示P起限制作用[49]。本試驗結果表明，這3種光合型豬毛菜體內N/P所處范圍屬于P起限制作用，且隨著向C4進化，這種限制作用逐漸減小，有研究表明低磷脅迫能顯著降低葉片相對含水量和葉綠素含量，同時，低磷脅迫能顯著降低葉片光合速率和氣孔導度[14]，因而C4進化過程中低磷脅迫越來越弱。

不同光合型豬毛菜應對貧瘠生境在生態化學計量特征方面表現出差異。結合所在區域生境土壤的營養元素，能揭示植物對營養元素的需要和當地土壤的養分供給能力，對植物與環境的適應與反饋能力都具有十分重要的意義[50]。土壤是植物生存的物質基礎和重要的環境條件，土壤C、N、P等養分含量是衡量土壤肥沃程度的重要指標，本試驗中，相較于C3蒿葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營養元素相對匱乏。同時，土壤C/N、C/P和N/P也是確定土壤C、N、P平衡特征的重要參數，全球和全國土壤C/N平均水平為14.3和10～12[51]，C3-C4松葉豬毛菜的C/N大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但都維持在全國平均水平附近，土壤有機層的C/N較低表明土壤有機層的有效氮含量相對較高，因此盡管C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境土壤C、N含量較低，但土壤有效氮含量與C3植物相當；陸生生態系統中，生物固氮量隨著土壤中N/P增大而減少，隨土壤中N/P減少而增大[52]，本試驗中C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜其生境土壤的生物固氮量明顯大于C3植物；較低的C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，我國土壤C/P的平均值為61[53]，豬毛菜生境中C/P明顯低于全國平均水平，從葉片營養元素分析中可看出豬毛菜植物受到低磷脅迫，C3-C4較低的土壤C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷濃度遠遠大于C3植物。這一結論與豬毛菜葉片存在低磷脅迫且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜能緩解低磷脅迫相一致。簡而言之，C3-C4物種松葉豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤P含量豐富且土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較低，但其葉片P元素利用率較高；C4植物東方豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較高。表明C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜采用不同的策略來緩解低磷脅迫。

C4進化的驅動因素之一是干旱，其形成受環境因子以及植物對環境的生物和生態適應性差異的影響，通過對這些指標進行主成分分析發現，在C4進化中，主要受兩大類因素影響，各因素的方差貢獻率分別為51.079%和48.921%。在第一主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3植物在第二主成分上具有較高的得分，表明相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物更能適應貧瘠的環境。

4 結論

本試驗基于 DNA 條形碼對 3 種光合型豬毛菜的生長適應性包括形態結構、抗旱生理和生態特征進行比較和評價，獲得以下主要結論，為完善C4進化理論提供表觀生長適應證據。

1)C3光合型豬毛菜是原始祖先，C3-C4中間型豬毛菜與C4光合型豬毛菜由C3光合型豬毛菜進化而來；2)與C3光合型蒿葉豬毛菜相比， C3-C4中間型松葉豬毛菜以及C4光合型東方豬毛菜葉從外部形態和解剖結構上逐漸形成適應干旱的結構特征，且種子的傳播策略也因種子大小不同而發生變化；3)C4光合型豬毛菜因高光合能力使其具備通過可溶性糖來調節滲透能力的物質基礎，從而提高抗旱能力；4)C3-C4型豬毛菜是通過提高氮和磷的利用效率來增加固碳量，C4光合型豬毛菜是通過氮和磷含量的增多來增加固碳量。相較于C3物種蒿葉豬毛菜，C3-C4物種松葉豬毛菜和C4物種東方豬毛菜更能適應貧瘠的環境。