液相色譜質譜聯用儀測定沙丁胺醇的不確定度評定

□ 陳楠瑜 潮州市食品檢驗檢測中心

測量不確定度是表征合理的賦予被測量值的分散性、與測量結果相聯系的參數，測量不確定度的大小反映了測量結果的質量高低，完整的測量結果應該包括測量不確定度。從實驗過程的數學模型，分析實驗過程的不確定度主要來源，對不確定度分量進行計算并評定，使該不確定度為今后改善β-受體激動劑殘留量檢測的測量程序，提高實驗測量精密度和準確性提供理論依據[1]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

市售豬肉；PCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）。

1.1.2 試劑

β-葡萄糖醛苷酸酶、乙酸銨（分析純）、氨水（分析純，含量：25%～28%）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）與沙丁胺醇標準物質溶液（編號：SB05-201-2008；產品批號：201901；北京壇墨質檢科技有限公司；濃度：100 μg/mL）。

1.2 儀器設備與條件

1.2.1 儀器

島津制作所（日本.京都）串聯四級桿液質聯用儀LCMS-8045；JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；V6旋渦混合器（廣州科橋實驗技術設備有限公司）；SB-5200DTD型超聲儀（寧波新藝超聲設備有限公司）；DK-S24恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；E3115臺式微量高速離心機（美國安勝科技有限公司）；Fotector-02HT固相萃取裝置（?？苾x器有限公司）；GM-0.5A真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）；N150-氮吹儀（廣州安勝儀器有限公司）。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Shim-pack GIST C18（50 mm×2.1 mm，2 μm）；進樣量：10 μL；流速為 0.4 mL/min；柱溫為30 ℃；流動相為A-0.1%甲酸/水：B-0.1%甲酸/乙腈，梯度洗脫，具體比例見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 質譜條件

干燥氣為氮氣，流速15 L/min，溫度350 ℃；霧化氣：氮氣，3.0 L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；電噴霧電離正離子模式ESI（+）；離子噴霧電壓4 500 V；質譜掃描方式：多反應離子監測（MRM）；駐留時間：20 ms；延遲時間：3 ms[2]。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 標準儲備液

準確移取沙丁胺醇標準品溶液1 mL（濃度：100 μg/mL）于 50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液濃度為2 μg/mL，于4 ℃冰箱中保存，有效期3個月。

1.3.2 標準工作液

根據需要，將標準儲備液配制成適當濃度的標準工作液，標準工作液在使用前配制。

1.4 數學模型

該檢測過程中的數學模型見式（1）。

式（1）中：X-樣品中沙丁胺醇含量（μg/kg）；c-標準曲線校準后試液中沙丁胺醇的濃度（ng/mL）；v-試液定容體積（mL）；m-試樣質量（g）；f-加標回收率。

2 各個分量不確定度的評定

2.1 標準物質及其配制過程引入的不確定度

根據標準物質證書信息，沙丁胺醇標準物質的不確定度為0.05 μg/mL，按正態分布考慮,包含因子為K=3，屬于B類評定，故其相對不確定度為U1rel=0.05/3=1.67×10-2。

2.2 標準溶液配制過程引入的不確定度

2.2.1 標準溶液配制過程中玻璃儀器校準引入的不確定度

標準溶液在配制過程中使用了一系列的玻璃器具，按照JJG 196-2006《常用玻璃量具檢定規程》的要求，均有相應的最大允差。歐洲分析化學中心（EU-RACHEM）認為其服從三角分布，故，計算不確定度分量。玻璃量具校準的不確定度見表2。

由表2中的數據合成的相對不確定度為：

2.2.2 溫度產生的不確定度評定

玻璃量具是在20 ℃下測量的，而實驗室溫度一般為（20±3）℃，由溫度的波動引起的不確定度可以通過估算溫度范圍和體積膨脹系數進行計算，標準溶液是用甲醇進行配制的，甲醇的膨脹系數為1.1×10-3/℃，玻璃的膨脹系數為9.75×10-6/℃，液體的膨脹系數遠高于玻璃的膨脹系數，所以玻璃的膨脹系數可以忽略不計，計算時假設溫度的變化是矩形分布，即，溫度變化引入的不確定度見表3[3]。

由表3數據合成的相對不確定度為：

2.3 標準工作曲線擬合引入的不確定度

實驗配制質量濃度分別為0.3、0.6、1.2 ng/mL與2.4 ng/mL的沙丁胺醇標準使用液，每個質量濃度平行測量6次，用最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積曲線，標準溶液的測量結果見表4[4]。

表2 標準溶液配制過程中玻璃量具校準引入的不確定度

表3 標準溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度

表4 沙丁胺醇標準曲線方程數據

標準曲線回歸方程為：y=132 122x+0，相關系數為R=0.999 887 7。

加標樣品經測定6次后，由線性方程得到測試液中沙丁胺醇的平均質量濃度（）為0.786 ng/mL，由擬合曲線求c時產生的標準不確定度計算公式見式（2）。

式（2）中：SR為從標準曲線求得的峰面積Y與相應測得的峰面積Yi之差所求出的標準偏差；m為樣品溶液的測定總次數，此處m為6；n為標準溶液的測定總次數，此處n為6；c為樣品中沙丁胺醇質量濃度的平均值；為標準溶液中沙丁胺醇質量濃度的平均值；ci為標準溶液中沙丁胺醇的質量濃度。將數據帶入計算得：

由標準物質、玻璃量具校準和溫度變化的標準不確定度分量及標準曲線擬合產生的不確定度分量合成標準曲線得出試樣中沙丁胺醇的濃度的相對標準不確定度為：

2.4 樣品的稱量引入的不確定度Urel（m）

用JJ 5 00天平（檢定證書給出最大允許誤差0.5 mg，重復性誤差0.3 mg）準確稱取樣品2.03 g，由稱量產生的不確定度按矩形分布考慮，包含因子，屬B類評定。其標準不確定度為：

2.5 體積引入的不確定度Urel（V）

（1）樣品定容過程中使用了一系列的玻璃量具。5 mL分度移液管（A級）的最大允許誤差是±0.025 mL，50 mL容量瓶的最大允許誤差是±0.05 mL。評定方法同2.2.1，則定容體積的相對不確定度U11、U12分別為2.04×10-3、4.08×10-4。合成的相對不確定度為：

（2）水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，樣品處理過程中因為溫度變化產生的的相對不確定度 U13、U14分別為 3.64×10-4、3.64×10-4。合成的相對不確定度為：

（3）則樣品定容過程中的總標準不確定度合成為：

2.6 樣品前處理引入的不確定度U(rel

取6次樣品分別添加20 μg/kg標準溶液進行處理并分析結果及回收率。6次檢測平均值為19.71 μg/kg，回收率測定結果為95.6%、97.8%、99.0%、101.0%、99.4% 與 96.6%，平均回收率為98.2%，標準偏差為S-f=1.96%，標準不確定度采用平均值的標準偏差，標準不確定度和相對標準不確定度分別為：

2.7 合成標準不確定度

將2.1～2.6各分量的不確定度合成得：

2.8 擴展不確定度

擴展標準不確定度：U=kUrel（X）=2×0.039=0.078。

由2.6中6次檢測平均值為19.71 μg/kg，則擴展不確定度為：U=19.71 μg/kg×0.078=1.54μg/kg。

3 測量不確定度報告

按照GB/T 22286-2008 《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》測定豬肉中沙丁胺醇的結果為：C=（19.71±1.54）μg/kg，k=2。