5-羥色胺對肺動脈平滑肌細胞瞬時受體電位通道/活化T細胞核因子蛋白表達的影響▲

韓俊麗 田紅燕 劉 亞 范粉靈

(1 西安交通大學第二附屬醫院重癥醫學科，陜西省西安市 710004，電子郵箱:lijunhan78@163.com；西安交通大學第一附屬醫院2 周圍血管科，3 呼吸科，陜西省西安市 710061)

肺高壓疾病是一組肺血管疾病的集合，這些疾病有一個共同特點，即用右心導管測量靜息時的平均肺動脈壓高于25 mmHg[1]。肺動脈高壓屬于肺高壓疾病中的一類[2]，其預后差，發生機制復雜，許多研究證實血管收縮分子和血管舒張分子之間，以及促增殖分子和抑制增殖分子之間存在不平衡，導致肺動脈內皮細胞功能失調和平滑肌細胞增殖從而引起肺動脈高壓[1，3]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)也稱血清素，是一種重要的血管收縮物質和神經遞質。5-HT假說于20世紀90年代提出，當時有學者觀察到一些原發性肺動脈高壓患者血漿5-HT水平升高；此外，減肥藥誘發的肺動脈高壓被認為與其間接的5-HT能效應有關[4]。因此5-HT與肺動脈高壓的發生發展有密切關系，但具體的機制需進一步研究。本研究探討5-HT及5-HT2A受體拮抗劑對肺動脈平滑肌細胞瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel,TRPC)/活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)蛋白表達的影響，以期為肺動脈高壓的機制研究提供更多參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，高糖杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購自Thermo Scientific公司，5-HT、5-HT2A受體拮抗劑酮色林、TRPC抑制劑SKF96365購自Tocris公司(批號：3547、0908、1147)， TRPC1抗體、TRPC6抗體購自Alomone公司(批號：ACC-010、ACC-017)，NFATc3抗體購自Santa Cruz公司(批號：sc-8321)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單抗購自Epitomics公司(批號：2251-1)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔多克隆抗體購自Abcam公司(批號：ab6721)。ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統購自Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養和干預 人肺動脈平滑肌細胞購于美國模式培養物集存庫(貨號為 PCS-100-023TM)。將細胞置于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基于5% CO2、溫度為37℃的培養箱中培養。培養至亞融合狀態，更換為無血清高糖培養基，繼續培養24 h后換為含0.2%胎牛血清的DMEM培養基。分3種方法干預24 h，每種干預方法設5個濃度梯度及對照組。3種干預方法分別為：(1)5-HT，設濃度梯度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；對照組不加5-HT。(2)5-HT+酮色林，其中5-HT設為10 μmol/L，酮色林設濃度梯度為0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、3.3 μmol/L、10 μmol/L；對照組只加10 μmol/L 5-HT，不加酮色林。(3)5-HT+SKF96365,其中5-HT設為10 μmol/L，SKF96365設濃度梯度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；對照組只加10 μmol/L 5-HT，不加SKF96365。

1.3 蛋白免疫印跡法測定TRPC1、TRPC6及NFATc3蛋白表達情況 培養皿中加入十二烷基硫酸鈉裂解液，用細胞刮刀收獲細胞，離心，提取肺動脈平滑肌細胞蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉1 h。加一抗(TRPC1抗體1 ∶200,TRPC6抗體1 ∶200,NFATc3抗體1 ∶100,GAPDH單抗1 ∶1 000)孵育過夜。TBST洗滌后加二抗(HRP標記的羊抗兔多克隆抗體,1 ∶5 000)室溫慢搖孵育1 h。TBST洗滌后，用化學發光法于凝膠成像系統成像。Quantity One軟件進行圖像分析。每組3個樣本，每個樣本重復3次。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度5-HT對肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響 與對照組相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；與0.1 μmol/L 5-HT組相比，33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)，10 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達水平升高(P<0.05)；與1 μmol/L 5-HT組相比，10 μmol/L、33 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達水平均升高，100 μmol/L 5-HT組TRPC6及NFATc3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；與10 μmol/L 5-HT組相比，100 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 不同濃度5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與0.1 μmol/L 5-HT組比較，#P<0.05；與1 μmol/L 5-HT組比較，aP<0.05；與10 μmol/L 5-HT組比較，bP<0.05。

圖1 不同濃度5-HT對肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響

2.2 不同濃度酮色林對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響 與對照組比較，0.01 μmol/L酮色林+5-HT組TRPC6蛋白表達水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的TRPC6及NFATc3蛋白表達水平均降低(均P<0.05)；與0.01 μmol/L酮色林+5-HT組比較，10 μmol/L酮色林+5-HT組的NFATc3蛋白表達水平降低(P<0.05)；與0.1 μmol/L酮色林+5-HT組比較，1 μmol/L酮色林+10 μmol/L 5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的TRPC6蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。見表2及圖2。

表2 不同濃度酮色林對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平的影響(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與0.01 μmol/L酮色林+5-HT組比較，#P<0.05；與0.1 μmol/L酮色林+5-HT組比較，aP<0.05。

圖2 不同濃度5-HT2A受體拮抗劑酮色林對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響

2.3 不同濃度SKF96365對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響 與對照組比較，10 μmol/L SKF96365+5-HT組、33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)；與0.1 μmol/L SKF96365+5-HT組比較，其余濃度SKF96365+5-HT組TRPC6蛋白相對表達水平均降低，且33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組NFATc3蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)；與1 μmol/L SKF96365+5-HT組比較，33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)。見表3及圖3。

表3 不同濃度SKF96365對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與0.1 μmol/L SKF96365+5-HT比較，#P<0.05；與1 μmol/L SKF96365+5-HT比較，aP<0.05。

圖3 不同濃度SKF96365對5-HT作用下TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達水平的影響

3 討 論

肺動脈高壓的組織學改變特點是遠端肺動脈壁內呈現廣泛的血管重塑，而肺動脈平滑肌細胞增殖是血管重塑的主要表現之一[1，5]。血管活性物質和相關信號通路是肺動脈高壓研究的熱點之一，許多血管活性物質參與調節肺血管收縮以及肺動脈平滑肌細胞增殖過程，例如內皮素-1、血小板衍生生長因子、血管生成素、成纖維細胞生長因子等。血管舒張因子與血管收縮因子之間的失衡被認為是肺動脈高壓發生發展的始動環節[6]。5-HT是一種血管收縮物質和神經遞質，也是血管平滑肌細胞的有絲分裂原，其還參與肺動脈高壓進展過程中肺動脈平滑肌細胞的增殖和重塑[6]。5-HT通過5-HT受體和轉運體進入細胞內發揮作用[4]。而5-HT2A受體與心血管系統關系密切，在平滑肌細胞和血小板中都有分布[7]。有學者通過高效液相色譜、放射酶學測定證實肺動脈高壓患者血漿中的5-HT濃度明顯高于正常人[8-9]。

TRPC和NFAT都是參與調節細胞內鈣離子水平和細胞增殖的重要分子[10-11]。TRPC是細胞內重要的非電壓門控的鈣離子通道，其有7個亞型，分別為TRPC1～7[10]。TRPC在鈣離子信號通路調節過程中起重要作用[10]，而鈣離子參與調控細胞增殖、血管收縮等病理生理過程[12]。在血管平滑肌細胞中最常檢測到的TRPC亞型有TRPC1、TRPC4、TRPC6[10]。許多研究證實TRPC與肺動脈高壓的發生發展關系密切。其中，Yu等[13]發現，在特發性肺高壓患者的肺組織和肺動脈平滑肌細胞中，TRPC3、TRPC6的mRNA和蛋白表達較正常壓力或繼發肺高壓患者的升高，用小干擾RNA抑制TRPC6表達可顯著降低特發性肺高壓的肺動脈平滑肌細胞增生。肺動脈高壓動物模型中也存在TRPC1、TRPC6等表達增高的現象[10]。NFAT可調節細胞的生長、凋亡等多種過程，參與心血管疾病、癌癥等疾病的發生發展。NFAT有5個類型，分別為NFATc1～c5，而參與肺動脈高壓病理生理過程的主要有NFATc1、NFATc2、NFATc3，三者在炎癥、肺動脈平滑肌細胞增殖、代謝異常等過程中發揮作用[14]。在成年小鼠中，NFATc3的激活可增加肺動脈壁厚度；NFATc3缺陷的成年小鼠在缺氧條件下右室壓在正常水平；慢性缺氧條件下，在新生小鼠肺動脈平滑肌細胞中觀察到NFATc3的核積聚現象[14]。因此本研究觀察了5-HT對肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達的影響。結果顯示，與對照組相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT組TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；但10～100 μmol/L的5-HT濃度組中，除了100 μmol/L 5-HT組NFATc3蛋白表達水平高于10 μmol/L 5-HT組(均P<0.05)，其他不同濃度組間的TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。這提示10～100 μmol/L的5-HT可上調肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達，但在該濃度范圍5-HT對以上蛋白的上調作用并無顯著的濃度依賴性。

我們進一步觀察5-HT2A受體拮抗劑酮色林對5-HT干預作用的影響。結果顯示，與對照組比較，0.01 μmol/L酮色林+5-HT組TRPC6蛋白表達水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT組、3.3 μmol/L酮色林+5-HT組、10 μmol/L酮色林+5-HT組的 TRPC6及NFATc3蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，提示濃度為0.01 μmol/L、1～10 μmol/L的5-HT2A受體拮抗劑酮色林，可抑制5-HT上調肺動脈平滑肌細TRPC6蛋白表達的作用。許多研究表明5-HT可引起肺動脈平滑肌細胞內鈣離子增加，而使用L型鈣通道(電壓門控鈣通道)阻斷劑并不能抑制5-HT引起的鈣離子變化[15-16]。在心肌細胞中，非電壓門控的鈣離子通道TRPC1參與了5-HT活化鈣調神經磷酸酶/NFAT的過程[17]。本研究還觀察了TRPC通道抑制劑SKF96365對5-HT作用下肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達的影響。結果顯示，與對照組比較，10 μmol/L SKF96365+5-HT組、33 μmol/L SKF96365+5-HT組、100 μmol/L SKF96365+5-HT組TRPC6、NFATc3蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)。這表明10～100 μmol/L的TRPC通道抑制劑SKF96365可以抑制5-HT上調肺動脈平滑肌細胞TRPC6、NFATc3蛋白表達的作用。因此我們推測5-HT可能與TRPC通道存在聯系，其可能通過直接參與調節TRPC通道，促進肺動脈平滑肌細胞增殖和肺動脈高壓的發生發展。目前關于5-HT與TRPC通道及相關信號通路之間的作用研究較少，值得進一步研究。但是，1～10 μmol/L酮色林以及10～100 μmol/L SKF96365，對TRPC6及NFATc3蛋白表達水平的影響差異并無統計學意義(P>0.05)，提示在一定范圍內提高酮色林、SKF96365的干預濃度可能并不能增強其作用效果，但這有待進一步的實驗研究來驗證。

綜上所述，5-HT可上調肺動脈平滑肌細胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表達，而5-HT2A受體拮抗劑酮色林和TRPC通道抑制劑SKF96365可抑制5-HT對肺動脈平滑肌細胞TRPC6和NFATc3蛋白表達的影響。5-HT與TRPC通道及相關信號通路之間的作用值得進一步深入研究，有可能成為肺動脈高壓新的治療靶點。