密花石豆蘭中石豆菲醌的色譜分析

李明娟，呂立華，楊 林

(邵陽(yáng)學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000)

醌類(lèi)化合物是指分子內(nèi)具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)具有較廣泛的生物活性，如殺菌、消炎、瀉下、抗病毒、抑制腫瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、提高機(jī)體免疫機(jī)能等[1-2]，臨床上可治療冠心病、心梗等[3]。天然的醌類(lèi)生物活性物質(zhì)，亦是一大類(lèi)抗腫瘤藥物，主要分布在 50 多科 100 多種高等植物的根、莖、枝、葉、果實(shí)及心材中[4]。研究天然植物中的醌類(lèi)化合物，對(duì)進(jìn)一步提高天然植物與藥物的利用價(jià)值具有直接指導(dǎo)意義。

天然菲醌(phenanthraquinone)衍生物包括鄰醌及對(duì)醌兩種類(lèi)型，含菲醌類(lèi)的植物分布在唇形科、蘭科、豆科、番荔枝科、使君子科、蓼科、杉科等高等植物中[5]。密花石豆蘭(Bulbophyllum odoratissimum Lindl),為蘭科植物云南石仙桃(Pholidota yunnanensis Rolfe)的干燥根狀莖和假鱗莖[6]，別名果上葉、羊奶果、極香石豆蘭、石串蓮，是土家族、苗族的民間常用藥物，對(duì)慢性咽炎，慢性氣管炎，肺結(jié)核咳嗽、咯血，瘡瘍腫痛等癥等其他慢性炎癥有較好的治療作用[7]。目前已從由植物密花石豆蘭中分出一個(gè)新型的鄰菲醌化合物石豆菲醌[8]。這類(lèi)菲醌成分生理活性多樣、顯著，有抗腫瘤活性，近年來(lái)成為各國(guó)學(xué)者研究的焦點(diǎn)。因此，對(duì)密花石豆蘭石豆菲醌的分析，對(duì)研究密花石豆蘭的藥用部位和價(jià)值具有指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該藥物打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑超聲提取的方法提取菲醌，建立硅膠薄層色譜的鑒別方法和高效液相色譜法定量分析方法，對(duì)其含量測(cè)定進(jìn)行了分析，據(jù)此亦可作為密花石豆蘭質(zhì)量控制的參考。

1 儀器和試藥

Waters2695高效液相色譜儀，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius 公司)；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；銳思捷超純水機(jī)Unique系列(南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司)；超聲波清洗器KQ3200B型(昆山市超聲儀器公司)；薄層層析所用硅膠(顆粒范圍 10～40 μm)(青島海洋化工廠)，石豆菲醌對(duì)照品(曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-14032101)；甲醇為色譜純由天津科密歐化學(xué)試劑公司提供，其它試劑均為分析純；液相用水為超純水。

2 溶液的制備

2.1 對(duì)照品準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取五氧化二磷干燥至恒重的石豆菲醌對(duì)照品25 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解，加水至刻度，搖勻，制得對(duì)照品貯備液，精密量取貯備液1 mL置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

密花石豆蘭干燥藥材粉碎，過(guò) 60 目篩，精密稱(chēng)定粉末25.0 g，加入250 mL甲醇，搖勻，精密稱(chēng)定，用超聲波清洗器于40 ℃水浴中超聲提取 30 min，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足至原稱(chēng)定重量，以6 000 r ·min-1離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即得供試品溶液[9]。

3 色譜方法建立與結(jié)果

3.1 色譜鑒別

以甲醇為溶劑，將供試品溶液稀釋配制為1 mg/mL的溶液，取供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中檢視，兩者在相應(yīng)位置出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)[10]，可確認(rèn)該供試品為石豆菲醌。

3.2 色譜定量分析

3.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為確定石豆菲醌標(biāo)準(zhǔn)品的最佳吸收波長(zhǎng)，應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)石豆菲醌標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描[11]，發(fā)現(xiàn)其在266 nm 波長(zhǎng)處具有最大吸收，因此，高效液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)選定為266 nm。

3.2.2 色譜條件

色譜柱：以Agilent Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水(60∶40)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm；柱溫：室溫30℃，進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下獲得對(duì)照品溶液、樣品溶液的色譜圖如圖1、2所示。

圖1 石豆菲醌對(duì)照品溶液高效液相色譜圖

圖2 密花石豆蘭供試品溶液高效液相色譜圖

3.2.3 線(xiàn)性與范圍

按照2.1項(xiàng)下制得的對(duì)照品貯備液，精密量取1.0、2.0、4.0、8、10.0 mL置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。依照上述高效液相色譜法條件記錄峰面積，各進(jìn)樣10μL。以石豆菲醌對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=687958X-1215，r=0.9892，實(shí)驗(yàn)表明，石豆菲醌在測(cè)定濃度為50～500μg·mL-1的范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.2.4 精密度試驗(yàn)

精取石豆菲醌對(duì)照品溶液，重復(fù)3天進(jìn)樣，每日重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，以測(cè)定其日內(nèi)精密度和日間精密度。計(jì)算待測(cè)峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果，日內(nèi)精密度為0.98%和日間精密度RSD為2.12 %，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精取同一供試品品溶液，在配制后室溫放置0、2、4、6、12、24 h分別進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.13%，說(shuō)明樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同批樣品，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液 6 份，分別按上述的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣,每份平行測(cè)定兩次，并計(jì)算各份的石豆菲醌含量，其RSD為1.39%，重現(xiàn)性良好。說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

3.2.7 回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)的密花石豆蘭樣品，含量為0.0986%，按上述2.2方法制備供試品溶液按上述色譜條件分離、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表明方法的回收率良好，準(zhǔn)確度較高，方法可行。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

3.2.8 樣品的含量測(cè)定及結(jié)果

取不同批次的5批密花石豆蘭，每批精密稱(chēng)取2.5g各3份，按上述2.2方法制備供試品溶液并測(cè)定石豆菲醌含量。結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 5批樣品含量測(cè)定的結(jié)果

4 討論

石豆菲醌系菲醌類(lèi)化合物，是新藥開(kāi)發(fā)研究中一個(gè)非常重要的資源。天然菲醌分為鄰菲醌及對(duì)菲醌兩種類(lèi)型，具有菲醌母核，屬于二萜類(lèi)化合物，建立天然菲醌化合物的分析方法，能對(duì)天然藥物的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。目前，對(duì)密花石豆蘭菲醌類(lèi)化合物的分離分析幾乎未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本課題經(jīng)過(guò)多次預(yù)試試驗(yàn)，采用有機(jī)溶劑超聲提取的方法能較大程度地提取菲醌化合物，通過(guò)硅膠薄層色譜建立初步的鑒別方法，并探索了高效液相色譜法定量分析的條件與方法，經(jīng)過(guò)一系列的方法學(xué)考察，證明該方法操作方便，分離效果好、精密度和重現(xiàn)性高，穩(wěn)定性好；測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能為密花石豆蘭石豆菲醌的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)，也為密花石豆蘭等其他蘭科植物的資源的開(kāi)發(fā)利用提供了分析方法。