甘藍中吡蟲啉的殘留量及清洗方式研究

馬偉超，李一婧，曹會弟

（天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅天水741001）

我國是一個農業大國，為確保農作物增產，在農業種植過程中大量使用各種化肥農藥和人工合成物[1]。但農藥在提高果蔬產量的同時也給蔬菜帶來農藥殘留問題[2]，殘留的農藥嚴重污染了水、空氣和土壤，再加上生物食物鏈的富集作用[3]，對人類的身體健康造成極大的威脅，嚴重時甚至會導致人畜出現中毒現象[4]，尤其是像甘藍這樣的人們日常膳食中必不可少的蔬菜。

甘藍（Brassica oleracea L.）的學名是“結球甘藍”，俗稱包菜、蓮花白、卷心菜、圓白菜等，在西方國家被看作保健價值很高的蔬菜[5]，里面含有多種微量元素，特別是邊葉中鈣含量可達26.5 g/kg，是葉球的3 倍多[6]，此外還有蛋白質、脂質、礦物質、維生素等。近年亦有研究表明，甘藍多酚類化合物中的吲哚類化合物對癌細胞具有一定的抑制作用[7]。甘藍可以做成各種各樣好吃又營養的美食，也是天水地區制作漿水的主要原料之一。漿水作為天水的特色小吃，可以作為預防中暑的飲料，也可以消炎降血壓，夏天常食有利于健康，用其做成的漿水面深受土生土長的天水人和外來游客的喜愛，因而甘藍在天水地區被廣泛種植。

吡蟲啉是甘藍種植過程中常用農藥之一，主要防治蚜蟲、葉蟬、飛虱、薊馬等刺吸式口器害蟲[8]，其化學名為 1-（6-氯-3 吡啶甲基）-N-硝基咪唑-2-亞胺，具有很好的內吸傳導性及高的選擇性和生物活性[9]，吡蟲啉具有神經毒性作用，能直接與乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）結合，引起不斷的刺激傳遞而缺少乙酰膽堿酯酶的消除能力，從而擾亂昆蟲正常的神經活動[10]，所以吡蟲啉是一種高效、內吸的廣譜性殺蟲劑[11]。除廣泛應用于果蔬、花草等害蟲防治外，還可用于家庭寵物衛生的防治，或用于運動場、高爾夫球場、社區等草坪害蟲的防控[12]。

隨著使用量的增加，吡蟲啉對生物及人群的毒性影響得到了人們越來越多的關注。研究表明，吡蟲啉對雄性大鼠經口LD50為681 mg/kg，雌性為825 mg/kg，經皮的LD50雌雄兩性都大于2 150 mg/kg，中毒的大鼠表現為抑制作用，出現呼吸急促、側臥等癥狀[13]。還有研究報道吡蟲啉具有改變DNA 鏈完整性、染色體完整性和致突變性等遺傳毒性[14]。閆文等對吡蟲啉毒性研究發現一定濃度范圍內的吡蟲啉可能有潛在影響學習記憶的作用[15]。此外，吡蟲啉對蜜蜂的毒性極高（LD50為 0.030 μg/只）[16]，歐洲食品安全局報道，包括吡蟲啉在內的3 種煙堿類農藥與蜜蜂數量大減有最為密切的關系，歐盟曾于2013年對其進行過為期兩年的禁用[17]。此外，土壤對吡蟲啉具有吸附性，而土壤中農藥的移動性能是評價農藥對地下水污染的重要指標，吡蟲啉是具有中等移動性的農藥品種，對地下水的污染有一定的影響[18]。可見吡蟲啉對人體和生物環境都有極大的威脅，檢測其殘留量十分必要。

近年來，隨著檢測技術的逐漸完善，水果蔬菜中的農藥殘留的分析方法有了很大的突破[19]，目前吡蟲啉殘留的檢測方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[20]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[21]、高效色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[22]、超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）[23]、熒光法[24]、和膠體金免疫層析法（the gold immunochromatographic assay，GICA）[25]等。例如李廣領等運用氣相色譜法檢測了卷心菜中吡蟲啉的殘留，結果顯示吡蟲啉在濃度為0.5 μg/L～100 μg/L 內有良好的線性關系，定量檢測限分別為0.005 3 mg/kg，該方法準確度與精密度好，實用性強[20]。張雪輝等用高效液相色譜法測定了西紅柿、結球甘藍等幾種蔬菜中的吡蟲啉，先用乙腈提取樣品，經過凈化等處理，再用帶有紫外檢測器的高效色譜儀進行測定，得出吡蟲啉在0.1 mg/L至1.0 mg/L 的添加范圍內線性關系較好，線性關系系數R2為0.992 5，西紅柿的平均回收率為95.4%～106.8%，相對偏差為2.66%～7.99%，最低檢測限為0.01 mg/kg，表明該方法能較準確、快速地監測蔬菜中的吡蟲啉[21]。梁秀美等用高效液相色譜-串聯質譜法測定了蜂蜜與蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物，此方法中樣品經酸化的乙腈提取兩次，再經新型凈化脫脂材料EMR 凈化，檢測結果顯示，蜂花粉和蜂蜜中吡蟲啉及其代謝物有良好的線性范圍，其相關系數在0.999 2～1.000 0 之間，吡蟲啉的檢出限為 0.2 μg/kg，定量檢出限為0.60 μg/kg，能滿足定量分析的基本要求[22]。譚國新等用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定了上海青基質中的吡蟲啉殘留，表明吡蟲啉在0.000 5 mg/L～0.5 mg/L 的線性范圍內，線性相關系數在0.999 5 以上，吡蟲啉的定量限低至3.1×10-6mg/kg，該方法靈敏度高，重現性好，滿足國內外對農藥殘留分析的相關要求[23]。趙曉陽等用熒光法測定了蘋果中的吡蟲啉，確定了吡蟲啉的最佳激發波長為234 nm，在蘋果汁中吡蟲啉的主特征波長為373 nm，且熒光強度隨吡蟲啉濃度的增加而增大，從而建立熒光法測定吡蟲啉的方法，具有便捷、快速等優點[24]。樓小華等采用以檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金標記吡蟲啉單克隆抗體的方法，創建并優化了膠體金免疫層析法，用膠體金免疫層析法快速檢測了煙草中吡蟲啉的殘留，其檢出限為5 μg/mL，檢出結果經氣相色譜法驗證，符合率高達96%，說明膠體金免疫層析法可對煙草中的吡蟲啉進行定性檢測，而且整個分析過程耗時短，超不過20 min，此方法具有快速簡便、靈敏度高等特點，適合市場監控、現場臨時抽檢等[25]。

綜上所述，在眾多的吡蟲啉的檢測方法中，熒光法和膠體金免疫層析法的檢測結果都有不確定性，需要進一步的驗證，過程繁瑣；雖然幾種液相的檢測方法中檢出限由高到低的排序是：超高效液相色譜-串聯質譜法＞高效液相色譜-串聯質譜法＞高效液相色譜法，但超高效液相色譜-串聯質譜儀和高效液相色譜-串聯質譜儀價格昂貴，許多實驗室都沒有配置；夏曉明等在綜述中也提到有相關試驗表明，氣相色譜法不適合直接測定吡蟲啉，帶有紫外檢測器的HPLC 法在各方面都優于GC，而且吡蟲啉是一個極性強但對熱不穩定的農藥[26]，因此本試驗采用高效液相色譜法研究天水市秦州區部分地區的甘藍中吡蟲啉的殘留情況以及清洗方式對殘留量的影響，為蔬菜購買地和清洗方式的選擇提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

吡蟲啉標準溶液（1 mg/mL）：上海晶純生化科技股份有限公司；吡蟲啉標準工作液：用甲醇（色譜純）稀釋吡蟲啉標準溶液1 000 倍至質量濃度為1 mg/L；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：默克股份有限公司；無水硫酸鎂（分析純）：成都市科隆化學品有限公司，200 ℃灼燒2 h，冷卻后置于干燥器中備用；乙腈（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；超純水：ULUP-II-10T 優普超純水器制得，電阻率為18.25 MΩ。

1.1.2 材料

甘藍：購自堅家河菜市場（A）、瀛池菜市場（B）、蘭天菜市場（C）、物美超市（D）、五洲超市（E）、蘭天超市（F）；容量瓶（500、1 000 mL）：四川蜀玻（集團）有限責任公司；離心管（50 mL）、一次性注射器（1 mL）、0.22 μm有機濾膜、自封袋等：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 型高效液相色譜儀（DAD 檢測器）：美國 Agilent 公司；ULUP-II-10T 型超純水器：四川優普超純科技有限公司；ME4002E 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H2100R 醫用離心機：長沙開發區湘儀離心機儀器有限公司；D500 均質機：北京大龍興創實驗儀器有限公司；A17 型破壁機：佛山市順德區格明電器實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

早上9 點左右去6 個銷售地點采樣，連續采3 d，將3 d 采的樣各取50 g（整個葉球的四分之一或八分之一）按購買地分類存放在冰箱的塑料袋中，3 個菜市場的甘藍邊葉按照相同的方法存放。

1.3.2 樣品的制備

將分好的樣品放入破壁機中勻漿，然后分別裝入貼好地方標簽的自封袋中，在冰箱中于-4 ℃保存。其中需要清洗的樣品在清洗時浸泡5 min，清洗完等自然晾干后再勻漿，每勻漿完1 個樣品，都要清洗破壁機，以免樣品之間交叉污染。

1.3.3 吡蟲啉標準曲線的測定

將配置好的濃度為1 mg/L 的吡蟲啉標準工作液分別按 0、4、5、10、15、20 μL（即 0、4、5、10、15、20 ng）進樣。

檢測條件為色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（美國 Agilent）；檢測波長：270 nm；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈/水=40/60（體積比）；流速：1.0 mL/min；樣品進樣量：20 μL。

1.3.4 甘藍中吡蟲啉殘留檢測

吡蟲啉的測定參考國家農業標準NY/T 1275-2007《蔬菜、水果中吡蟲啉殘留量的測定》[27]：準確稱取10 g 左右（精確至0.01）樣品于50 mL 具塞離心管中，加入乙腈10 mL，在高速均質機上均質2 min，然后加入無水硫酸鎂6 g，在渦旋振蕩器上振蕩搖勻后靜置30 min，在轉速為4 000 r/min 的離心機上離心4 min，用移液槍將上清液全部轉入另一50 mL 的具塞離心管中，用氮吹儀40 ℃下濃縮至干，然后加入1 mL 的甲醇溶解，超聲20 s 保證它們充分溶解，再經0.22 μm 的有機膜濾入進樣瓶，每份樣品做3 個平行樣，待測，檢測條件同上。

1.3.5 數據分析

試驗數據使用SPSS V20（IBM 公司）進行分析，各試驗條件數據均采用單因素方差分析（ANOVA）及Tukey Post Hoc 檢驗。圖表制作使用OriginPro 8.1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

吡蟲啉標準曲線圖見圖1。

圖1 吡蟲啉標準曲線圖Fig.1 Standard curve of imidacloprid

以吡蟲啉的含量（0、4、5、10、15、20 ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線圖，由圖1 可以看出，吡蟲啉在色譜柱為 C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm、檢測波長為270 nm、柱溫為40 ℃、流動相為乙腈+水（40+60）、流速為1.0 mL/min 的條件下有較好的線性關系，線性回歸方程方程為y=2.660 4x+0.716 7，相關系數R2為0.998 6。

2.2 不同來源的甘藍中吡蟲啉的殘留情況

對不同銷售地點采購的甘藍中吡蟲啉殘留量進行了檢測見圖2。

圖2 不同來源的甘藍中吡蟲啉的殘留量Fig.2 Imidacloprid residues in cabbage from different market

由圖2 可知，堅家河菜市場（A）的吡蟲啉含量明顯高于其他地方（p=0.013，α=0.05），吡蟲啉殘留量達到0.25 mg/kg，但未超過GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定甘藍中吡蟲啉的最大殘留量為1 mg/kg[28]。高的原因可能是甘藍在生長的每個階段都在使用吡蟲啉，而且噴藥間期太短，造成了農藥在甘藍中的積累。蘭天超市的甘藍未檢出，說明之前沒有噴灑農藥或早期噴灑的吡蟲啉降解，殘留量太小而未檢出。菜市場的甘藍中吡蟲啉的殘留量普遍高于超市的，其可能的原因是菜市場賣家一般都是當地的菜農，噴藥的時間和方式一般很隨意，次數也比較頻繁，沒有食品安全意識。而超市在采購蔬菜時通常會對農藥殘留進行快速檢測，一定程度上控制了蔬菜種植過程中的農藥使用量和噴藥時間。

2.3 甘藍邊葉與葉球中吡蟲啉殘留量的比較

根據形態的變化，甘藍的生長過程一般分為幼苗期，定植期，始球前期，結球期和收獲期[29]，可見邊葉比葉球形成的早，所以經歷的噴藥次數也多，而且兩者結構形態不同，使人們產生了邊葉中農藥殘留量多于葉球的誤解。因此，對3 個菜市場的甘藍邊葉與甘藍葉球中吡蟲啉殘留量進行了測定，堅家河菜市場（A）采購的甘藍葉球與另外兩個市場銷售的甘藍葉球存在顯著差異（p＜0.01，α=0.05），堅家河菜市場（A）銷售的甘藍邊葉與蘭天菜市場（C）銷售的甘藍邊葉有顯著差異（p=0.029，α=0.05），結果見圖3。

有研究表明吡蟲啉在水中即使無催化劑也能在紫外光照射下會被降解成簡單的無機物，并且光照強度越大，降解速度越快[30]，作為在最外層的邊葉，它們受到的陽光照射和雨水比葉球多，導致部分農藥降解；甘藍邊葉吸收的養分會向葉球運輸[6]，所以殘留在土壤中的吡蟲啉經根部吸收，再由邊葉轉運給葉球，再加上吡蟲啉是一種內吸性農藥，蔬菜的不同部位對吡蟲啉的吸收不同[31]，這幾點導致葉球中吡蟲啉的含量大于邊葉。

圖3 3 個菜市場的甘藍邊葉和葉球中的殘留量Fig.3 Imidacloprid residues in side leaves and leafballs of cabbage from three vegetable markets

2.4 同一來源的甘藍清洗效果的比較

由于購自堅家河菜市場（A）的甘藍檢測出少量吡蟲啉的殘留（如2.2 和2.3 所示），為研究不同清洗方法對吡蟲啉的去除效果，選用采購于A 市場的甘藍為研究材料，分別將邊葉和葉球使用清水、淡堿水（1.5%）和鹽水（0.9%）浸泡5 min，而后清洗、自然晾干后再勻漿、檢測。以未清洗的甘藍為對照，得出不同清洗方法的吡蟲啉去除效果如圖4 所示。

圖4 不同清洗方式處理后甘藍中吡蟲啉的殘留量及去除率Fig.4 Residue and removal rate of imidacloprid in cabbage treated by different cleaning methods

雖然3 種清洗方式都能減少農藥的殘留量，但堿水和鹽水的去除效果比清水好，清水對邊葉的去除率為18.1%，葉球的去除率為80.09%，堿水和鹽水對邊葉和葉球的去除率都為100%，這與吡蟲啉的性質有關，有研究表明，吡蟲啉在中性或酸性條件下水解不明顯，在弱堿條件下能緩慢水解，并且隨著堿性增強，水解的速度也會明顯加快[32]。清水對邊葉和葉球的去除率也有明顯的差異，主要由于吡蟲啉在水中的溶解度為 0.51 g/L（20 ℃），在水中有一定的溶解度[33]，甘藍葉球的水分含量比邊葉大，因而葉球比較容易除去。所以洗菜的時候可以用少量的鹽和堿等有效的去除劑來減少果蔬中的農殘，洗邊葉的時候可以多洗幾次。

農藥是一把雙刃劍，適當地使用會提高農產品產量，大量使用會降低農產品的質量[34]。農藥在現代農業生產中不可或缺，過量使用會導致環境污染和人體健康的損害等一系列問題，對于這種現象，政府相關部門應一方面加強宣傳教育，提高果樹種植戶對農藥危害的認識，使他們能合理使用農藥，學習農藥正確的使用方法，掌握好農藥的安全間隔期。另一方面加大監管力度，制定合理的管理規則，保證食品質量安全[35]。作為消費者，也應該有食品安全意識，在買菜時去相對正規的地方去買，在食用時應選擇有效的清洗方式。

3 結論

本文利用高效液相色譜法檢測了天水市區不同銷售地點的甘藍中吡蟲啉的殘留量，并對比了甘藍的邊葉和葉球上吡蟲啉殘留量，以及不同清洗方式對殘留的吡蟲啉去除效果，主要得出3 個結論（1）天水市秦州區不同銷售地點采購的甘藍中的吡蟲啉殘留量均未超出GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》要求；（2）甘藍葉球的殘留量高于邊葉；（3）使用堿水和鹽水清洗可有效去除甘藍中殘留的吡蟲啉。