響應面法優化甘薯莖中可溶性蛋白的超聲輔助提取工藝

高琦，孫怡，程健，劉梓蘅，吳嘉樂，薛友林，*

（1.遼寧大學輕型產業學院，遼寧沈陽110036；2.中共遼寧省委黨校，遼寧沈陽110161）

甘薯是屬旋花科甘薯屬的一年生草本植物，四百多年前由南美洲傳入我國，并在我國得到廣泛種植，如今我國甘薯產量約占世界的80%。甘薯富含多種營養成分以及氨基酸、維生素、黏液蛋白等多種功能因子，歐洲人評價它是“第二面包”，前蘇聯的科學家們說它會是未來的“宇航食品”[1]。目前我國實驗室中甘薯葉的利用量較大，而甘薯莖的利用量相對較少。甘薯在我國種植及其廣泛，其葉在南方作蔬菜食用，而在收獲季節時易變黃萎蔫不能食用，剩下的是大量的莖，甘薯莖富含多種營養物質，其中含有大量蛋白質，有很大的開發利用價值[2-9]，本試驗即以甘薯莖為試驗對象，探討甘薯莖蛋白提取的優化方法。

可溶性蛋白質的提取方法有很多種，其中最常用的方法就是堿提酸沉法，除此之外還有離子交換法和超濾膜法。甘薯葉可溶性蛋白可以用堿提酸沉法，乳酸發酵酸法[10]，響應面法優化纖維素酶提取葉蛋白工藝方法[11]，泡沫法分離提取葉蛋白等多種方式[12]，而甘薯莖可溶性蛋白的提取方法尚未開發出特別的方法，所以與大多數提取甘薯塊根蛋白采用的方法相同，本試驗采用堿提酸沉法提取甘薯莖中的蛋白質，該方法操作簡單、條件易于控制、試驗成本低，是目前提取蛋白質應用最多的方法[13]。堿性環境能夠使植物細胞的緊密結構變得疏松，蛋白質更容易從細胞內部溶出，同時，體系中的料液比、pH 值以及溫度也會引起蛋白質提取率的變化。近年來的研究表明，超聲波輔助提取蛋白質對提取率也有一定的影響，因此，本試驗先進行單因素試驗來初步確定堿提酸沉法提取甘薯莖中蛋白質的主要參數，然后利用響應面法對超聲波輔助提取甘薯莖蛋白的工藝條件進行了優化，為日后甘薯莖的開發利用提供理論依據[14-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯莖：市售。

亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FB124 電子電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；722N 可見分光光度計：上海精密儀器有限公司；TG16G 臺式高速離心機：長沙英泰儀器有限公司；PHS-3CB 型pH 計：上海越平科學儀器有限公司；SZ-500A-3 超高速多功能粉碎機：永康市善竹貿易有限公司；TH-400 BQ 型數控超聲波清洗機：濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯莖可溶性蛋白提取工藝流程

將新鮮的甘薯莖烘干，進行打粉過篩，得到甘薯莖粉，取一定量的甘薯莖粉，加入一定體積的含有0.05%亞硫酸氫鈉的溶液將甘薯莖粉混勻。用1 mol/L 的氫氧化鈉和1 mol/L 的鹽酸調節溶液的pH 值達到一定的值后，將得到的溶液放入離心機中進行離心（6 000 r/min，30 min），然后將離心后得到的上清液的pH 值調到等電點進行酸沉，攪拌3 min～5 min 后，離心（6 000 r/min，30 min），得到的沉淀物加水回溶，并將pH 值調回到7，再經冷凍干燥后即可得到甘薯莖蛋白粉[18-19]。

1.3.2 理化指標測定

1.3.2.1 水分的測定

采用GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》，標準第一法即直接干燥法，對甘薯莖粉的水分進行測定。先把洗凈的錐形瓶放于105 ℃的干燥箱中，烘1 h～2 h 后取出，冷卻至室溫25 ℃后進行稱重，并重復上述操作直至恒重。稱取甘薯莖粉樣品5 g放入錐形瓶中，稱重后用紙巾封口放入烘箱中，在105 ℃下烘2 h，取出錐形瓶冷卻至室溫25 ℃后去掉紙巾進行稱重，重復上述操作至兩次稱重差值不超過0.4 mg 為止。水分含量按以公式計算：

式中：m1為干燥前錐形瓶與樣品的總重量，g；m2為干燥后錐形瓶與樣品的總質量，g；w 為樣品的質量，g。

1.3.2.2 國標法測定甘薯莖總蛋白含量

原料中蛋白質含量參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[20]凱氏定氮的方法進行測定：

式中：V1為消化液消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V2為空白試液消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V3為消化液的體積，mL；c 為鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L。

1.3.2.3 考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量

考馬斯亮藍G-250 的配制：稱取考馬斯亮藍G-250樣品100 mg，將其溶解于50 mL 90%的乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，最后在容量瓶中定容至1 000 mL，獲考馬斯亮藍G-250 溶液，將制得的溶液用中性濾紙過濾，放在棕色瓶中保存以備用。

標準曲線的繪制：取6 支試管，分別加200 μg/mL牛血清蛋白標準溶液 0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，各管以去離子水補齊至0.5 mL。各管加考馬斯亮藍G-250 工作液2.5 mL，旋渦混合器混勻，2 min 后于分光光度計595 nm 處測吸光值，1 h 內測完。以試管中牛血清白蛋白微克數為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制牛血清白蛋白標準曲線。

1.3.2.4 可溶性蛋白的提取率

本試驗中蛋白質提取率以甘薯莖中可溶性蛋白占總蛋白比率為指標。甘薯莖中可溶性蛋白提取率用以下公式計算。

式中：X 為甘薯莖中可溶性蛋白提取率，%；m1為可溶性蛋白質量，g；m2為總蛋白的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 料液比對甘薯莖可溶性蛋白質的提取率的影響

在提取液pH 值為10.0，酸沉pH 值為4.5 的條件下，分別設定料液比為 1 ∶1、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70、1 ∶80（g/mL）進行試驗，計算甘薯莖蛋白在不同的料液比之下的提取率，進而得到最佳的料液比。

1.3.3.2 堿提pH 值對甘薯莖可溶性蛋白提取率的影響

稱取10 份甘薯莖粉，每份5 g，配制0.05%的亞硫酸氫鈉溶液 1 500 mL，以 1 ∶30（g/mL）的料液比將甘薯莖粉溶解，調節 pH 值（分別為 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0）進行蛋白質的提取，計算出甘薯莖蛋白在不同的pH 值下的提取率，以得到最佳的堿提pH 值。

1.3.3.3 酸沉pH 值對甘薯莖可溶性蛋白質的提取率的影響

在料液比為 1 ∶40（g/mL），堿提 pH 值為 10.0 的條件下，分別設定酸沉 pH 值為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 進行蛋白質提取，計算甘薯莖蛋白在不同的酸沉pH 值下的提取率，確定最佳的酸沉pH 值。

1.3.3.4 超聲功率對甘薯莖可溶性蛋白質的提取率的影響

在料液比為 1 ∶40（g/mL），堿提 pH 值為 10.0，酸沉pH 值為4.0，超聲溫度為40 ℃的條件下，設定不同的超聲功率（分別為 160、240、320、400 W）對甘薯莖中的蛋白質進行提取，計算甘薯莖蛋白在不同的超聲功率下的提取率，確定最佳的超聲功率。

1.3.3.5 超聲時間對甘薯莖可溶性蛋白質的提取率的影響

在料液比為 1 ∶40（g/mL），堿提 pH 值為 10.0，酸沉pH 值為4.0，超聲功率為240 W，超聲溫度為40 ℃的條件下，設定不同的超聲時間（分別為10、20、30 min）對甘薯莖蛋白進行提取，計算甘薯莖蛋白在不同的超聲時間下的提取率，確定最佳的超聲時間。

1.3.3.6 超聲溫度對甘薯莖可溶性蛋白質的提取率的影響

在料液比為 1 ∶40（g/mL），堿提 pH 值為 10.0，酸沉pH 值為4.0 的條件下，分別設定超聲溫度為20、30、40、50 ℃對甘薯莖可溶性蛋白進行提取，計算甘薯莖可溶性蛋白不同的超聲溫度下的提取率，最終確定最佳的超聲溫度。

1.3.4 Box-Behnken 試驗設計

利用Design-Expert8.0.6 軟件，應用Box-Behnken設計，把甘薯莖可溶性蛋白質提取率做為響應值，比較各因素對響應值的影響，并對主要影響因素進行優化試驗，從中篩選出甘薯莖可溶性蛋白質的最優提取條件。根據Box-Behnken 試驗設計原理[21]，對超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）3 個影響因素進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，確定響應面試驗的因素和水平，進行回歸擬合建立回歸模型見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 試驗設計及數據分析

試驗每組處理重復3 次，取平均值作為結果。采用OriginLab Origin Pro v7.5 軟件對數據進行制圖和分析；Design-Expert8.0.6 軟件進行響應面設計和結果分析。

2 結果與分析

2.1 考馬斯亮藍G-250 標準曲線

測定6 個濃度的牛血清蛋白在波長595 nm 處的吸光值，以每個濃度的平均吸收值（A595）為縱坐標，蛋白質溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線見圖1。由圖1可知得到曲線方程為：Y=0.007 6X-0.003，R2=0.997 9，經顯著性檢驗，回歸關系達到顯著水平。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對甘薯莖蛋白提取率的影響

料液比對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖2。

圖1 考馬斯亮藍G-250 標準曲線Fig.1 The standard curve of the coomassie brilliant blue G-250 solution

圖2 料液比對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of sweet potato stem proteins

甘薯莖中的可溶性蛋白質的提取率隨著料液比的增加而增加，其增速先快后緩慢。在料液比為1 ∶10（g/mL）時，蛋白質的提取率最低，為 33.73%，此后隨著料液比的增加，蛋白質提取率也增加，在料液比為 1 ∶40（g/mL）時，提取率達到 43.05%，這是由于在料液比較低時，甘薯莖粉得不到充分的溶解，因此蛋白質的溶出速率也較低。隨著提取液的量的增加，稀釋作用變強，提取液的黏度降低，蛋白質的濃度也降低，蛋白質的溶出量增加，從而使提取率增加[22]。當料液比大于1 ∶40（g/mL）時，溶液的黏度以及蛋白質的濃度都很低，隨著溶液的稀釋，蛋白質的溶解增加作用不再顯著，因此，蛋白質提取率的增加變得緩慢。綜上所述，以及結合經濟方面因素，選擇 1 ∶40（g/mL）為最佳的料液比。

2.2.2 堿提pH 值對甘薯莖蛋白提取率的影響

堿提pH 值對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖3。

甘薯莖蛋白隨著抽提pH 值的增加，提取率先升高后降低。在pH 值在7～10 時，甘薯莖的蛋白質提取率隨著pH 值的增加而升高，當pH 值為10 時提取率達到最大值，為42.15%。這是由于堿液能使細胞自身的緊密結構變得疏松，破壞蛋白質的氫鍵，使蛋白質分子表面帶同種電荷，從而提取率升高。當pH 值大于10 時，由于堿性過度引起了脫羧、脫氨和肽鍵的斷裂，導致蛋白質變性和過度水解，同時提取物中的非蛋白質物質含量增加，蛋白質提取率降低[22-25]。因此選取pH10 為最佳的堿提pH。

圖3 堿提pH 對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on the precipitation of sweet potato stem proteins

2.2.3 酸沉pH 值對甘薯莖蛋白提取率的影響

酸沉pH 值對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 pH 對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of sweet potato stem proteins

隨著pH 值的增加，甘薯莖蛋白的提取率先升高后降低，在pH 值等于4 時，蛋白質提取率達到最大，為43.27%，這是因為蛋白質顆粒在等電點時溶液中不存在同種電荷的相互排斥作用，容易發生相互碰撞而沉淀，因此最佳酸沉pH 值為4。

2.2.4 超聲功率對甘薯莖蛋白提取率的影響

超聲功率對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖5。

隨著超聲功率的增加，甘薯莖蛋白的提取率先升高后降低而后又有小幅上升，這可能是由于微波功率過大易造成溫度過高使蛋白質分解，導致蛋白質的得率降低[26]。綜上所述，選擇240 W 為最佳超聲功率。

2.2.5 超聲時間對甘薯莖蛋白提取率的影響

超聲時間對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖6。

圖5 超聲功率對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of sweet potato stem proteins

圖6 超聲時間對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of sweet potato stem proteins

隨著超聲時間的增加，甘薯莖蛋白的提取率先升高后降低。當超聲時間小于20 min 時，超聲波空化作用強，使細胞破碎程度增大，加速了細胞內蛋白質的溶出，當時間超過20 min 時，隨著時間的延長部分蛋白質變性，甘薯莖粉顆粒表面對蛋白的吸附力增強[26-29]，使蛋白質溶出量下降。因此選擇20 min 為最佳超聲時間。

2.2.6 超聲溫度對甘薯莖蛋白提取率的影響

超聲溫度對甘薯莖蛋白提取率的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對甘薯莖蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the yield of sweet potato stem proteins

隨著超聲溫度的升高，蛋白質質量增加，但是隨溫度升高蛋白質純度先升高后降低，推測多糖等物質也因超聲而沉淀析出[26-29]，因此選擇40 ℃時為最佳。

2.3 超聲協同堿提酸沉工藝的優化

2.3.1 響應面試驗結果及方差分析

根據單因素試驗結果，選取合理的因素和水平進行響應面試驗，確定最佳的提取條件。甘薯莖蛋白提取的Box-Benhnken 試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表3 響應面試驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

利用設計軟件Design-Expert 對數據進行多元回歸擬合，獲得超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）的二次回歸方程為：

從表3 中可以看出，模型的P＜0.000 1，模型顯著，失擬項P=0.157 9，失擬項不顯著。由F 值的大小可以看出各因素影響結果的主次順序為B（超聲溫度）＞A（超聲時間）＞C（超聲功率）。模型的確定系數為R2=0.984 0，表明模型能夠解釋絕大多數因變量變化。綜上所述，模型擬合良好，模型成立。

2.3.2 各因素交互作用的響應面分析

為了對超聲時間（A）、超聲溫度（B）以及超聲功率（C）3 者之間的交互作用進行更進一步的探究，并確定最優點，對得到的模型使用降維法，得到兩種因素的回歸模型，并通過Design-Expert 8.0 軟件繪制出響應面曲線圖，以便進行更直觀的分析。圖8a～d 分別顯示了2 組以甘薯莖蛋白提取率為響應值的趨勢圖，從圖中可以直觀地看出兩變量交互作用的顯著程度。

圖8 響應面分析圖和相應等高圖Fig.8 Response surfaces and contour plots for the interactions

圖8a～d 直觀的反映出了各個因素之間的交互作用對響應值的影響。從圖8a 和圖8b 可知，當超聲時間一定時，甘薯莖蛋白的提取率隨著超聲溫度的增加先增加后減少，當超聲溫度一定時，隨著超聲時間的增加，甘薯莖蛋白提取率呈上升趨勢，從等高線的圖形和疏密程度可知，超聲時間和超聲溫度的交互作用明顯，超聲溫度對提取率的影響稍大于超聲時間。從圖8c 和圖8d 可知，當超聲功率一定時，隨著超聲溫度的增加，甘薯莖蛋白的提取率減少，由等高線的形狀及其疏密程度可知，超聲溫度和超聲功率的交互作用較顯著，超聲溫度對甘薯莖蛋白的提取率的影響大于超聲功率的影響。

2.3.3 最優工藝的確定與驗證

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到甘薯莖蛋白最佳提取工藝參數為超聲溫度30 ℃、超聲時間25 min，超聲功率280 W，此條件下得到蛋白理論提取率為51.75%，對優化參數進行3 次重復驗證，蛋白提取率為48.75%，蛋白質純度為46.27%。軟件的預測值與驗證試驗所得的結果較為接近，偏差較小。該結果說明利用響應面法對提取工藝進行的優化，其結果較為準確、可靠，有一定的實用價值。

3 結論

依照單因素試驗得出的結果確定出提取甘薯莖蛋白的最佳提取條件為：堿提pH10，料液比為1 ∶40（g/mL），酸沉 pH4，提取溫度為 40 ℃，超聲功率為240 W，超聲時間為20 min。然后在單因素試驗的基礎上，利用響應面法，選取超聲溫度、超聲時間和超聲功率作為3 個影響因素進行分析，經試驗得到各因素對甘薯莖蛋白提取率的影響大小依次為：超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率，最佳提取工藝為超聲溫度30 ℃，超聲時間25 min，超聲功率280 W，此條件下甘薯莖蛋白提取率的理論值為51.75%。以得到的最佳條件做3 組試驗進行驗證，得到甘薯莖蛋白的提取率為48.75%，并測得所得的蛋白質純度為46.27%，預測值與實際試驗所得值較為接近，試驗結果比較理想。