基于好氧甲烷氧化菌的反硝化效能及微生物群落研究

李彥澄,楊婭男,劉鄧平,李 蕾,李 江

基于好氧甲烷氧化菌的反硝化效能及微生物群落研究

李彥澄*,楊婭男,劉鄧平,李 蕾,李 江

(貴州大學資源與環境工程學院,貴州 貴陽 550025)

采用氣體循環序批式生物膜反應器(gcSBBR),構建反硝化型甲烷好氧氧化(AME-D)系統.考察了進水氮負荷的影響,發現氮負荷為0.075kg/(m3·d)時,硝酸鹽氮去除率達到98.93%,其反硝化速率為74.25mg/(L·d),系統的甲烷日平均消耗量為35.91%(初期為50%);掃描電子顯微鏡(SEM)分析結果顯示,系統中的微生物主要以短桿菌(12~18 μm)為主,并存在少量的絲狀菌(長150~200 μm);16S rRNA高通量測序結果顯示,該系統中的甲烷氧化菌為、、和_ unclassified,反硝化菌為、、、和,其中主要的功能微生物為、和,系統對氮的去除是由好氧甲烷氧化菌與反硝化菌協同實現.此外,系統中存在大量以甲醇和甲基胺類物質為生長基質的_ uncultured(30.4%).

反硝化型甲烷好氧氧化(AME-D)；甲烷氧化菌；反硝化；gcSBBR；功能微生物

甲烷氧化菌能以甲烷作為唯一的碳源和能源物質,廣泛分布于自然環境中,如生活垃圾衛生填埋場[1]、泥炭沼澤[2]、煤礦坑[3]、污水處理廠污泥[4]、土壤[5]、水庫與河流沉積物[6]和深海沉積物[7]等,在碳循環、氮循環和氧循環中起重要作用.相關研究發現,甲烷氧化菌在氧化甲烷的同時能實現氮的去除,該過程分為反硝化型甲烷好氧氧化(AME-D)[8]和反硝化型甲烷厭氧氧化(ANME-D)[9],如薛松等[10]在研究中構建出反硝化型甲烷厭氧氧化系統,發現甲烷轉化率為34.7%,并對系統中的微生物進行了分析; Modin等[11]在膜生物反應器中成功富集了具有脫氮能力的甲烷氧化菌,培養過程中采用的氣體為沼氣,并得出了脫氮和甲烷利用之間的關系為0.25~0.36molN/molCH4,發現了生物膜表面的優勢菌群為I型甲烷氧化菌. AME-D和 ANME-D過程均能有效實現氮的去除,但AME-D過程需要氧的參與.此外,反硝化型甲烷氧化能實現對甲烷的資源化利用,減少甲烷的排放,減緩甲烷排放導致的溫室效應.由上述可知,反硝化型甲烷氧化具有顯著的經濟和環境效益,日益受到關注.

目前,關于反硝化型甲烷好氧氧化過程(AME- D)的作用機理存在兩種解釋:①反硝化過程由好氧甲烷氧化菌實現,相關研究發現,部分甲烷氧化菌的基因中含有脫氮基因、和等[12];②反硝化過程由好氧甲烷氧化菌和反硝化細菌協同實現,甲烷氧化菌氧化甲烷會產生中間產物,如甲醇、甲醛、乙酸鹽和檸檬酸鹽等,所產生的中間產物為反硝化細菌提供碳源[8].AME-D的反應過程可通過表1中的化學方程式進行描述.

表1 反硝化型甲烷好氧氧化(AME-D) 化學方程式[8]

為了探究反硝化型甲烷好氧氧化過程(AME-D)的脫氮效能及功能微生物,研究采用氣體循環序批式生物膜反應器(gcSBBR),構建反硝化型甲烷好氧氧化系統,考察了進水氮負荷的影響,采用氣相色譜儀(GC)分析反應器中甲烷氣體的變化,通過掃描電子顯微鏡(SEM)分析系統中微生物的形態,并采用16S rRNA高通量測序分析微生物種群結構,識別主要的好氧甲烷氧化菌與反硝化菌.研究結果可為甲烷與氮的有效控制提供理論依據,并能為脫氮工藝的改進提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

圖1 氣體循環的序批式生物膜反應器(gcSBBR)

① 水箱; ②進水; ③出水; ④ CH4進氣口; ⑤ O2進氣口; ⑥正-負壓力表; ⑦通氣口; ⑧取樣口; ⑨空氣進氣口; ⑩單向閥;?蠕動泵;?出水及取樣口;?氣體循環管;?曝氣頭;?熱水循環管;?NMS 培養液及廢水進入口;?進水箱;恒溫水浴鍋

采用氣體循環序批式生物膜反應器(gcSBBR),該試驗裝置由氣罐(有效容積為5L)和生物膜反應器(有效容積為2.25L,纖維絲柔性填料,填充率為45%)兩部分組成(圖1),使反應器中同時形成厭氧、缺氧和好氧環境.氣體在氣罐和生物膜反應器之間通過蠕動泵進行循環,進水從反應器的頂部重力加入,通過循環熱水控制溫度.

1.2 試驗水質

試驗進水采用人工配水,其中氮污染物采用KNO3模擬,其他營養物質與Nitrite Mineral Salt (NMS)培養液[13]相同,其濃度分別為(mg/L): MgSO4·7H2O,1000;CaCl·2H2O,200;Fe-EDTA,0.38;Na2MoO4·H2O,0.26;FeSO4·7H2O,0.90;MnCl2·4H2O,0.02;CoCl2·6H2O,0.05;H3BO3,0.015;Na-EDTA,0.25;ZnSO4·7H2O,0.40;NiCl2·6H2O, 0.01;CuSO4·5H2O,1.25; Na2HPO4·12H2O,71.60;KH2PO4·7H2O,26.00.

1.3 試驗方法

反應器接種污水處理廠濃縮池污泥,接種的干污泥量為8g/L,加入混合氣體為甲烷:氧氣=1:1,即甲烷比例為50%,控制反應器的溫度為30℃,采用間歇式運行的方式,運行周期為“進水0.5h-反應23h-出水 0.5h”,排水比為1/2,進水的同時更新反應器中的混合氣體.反應器運行初期的進水硝酸鹽氮濃度為150mg/L(即氮負荷:0.075kg/(m3·d)),待反應器運行穩定后,調節進水硝酸鹽氮濃度分別為300mg/L(即氮負荷:0.15kg/(m3·d))和500mg/L(即氮負荷:0.25kg/ (m3·d)).采集每個周期的進氣和出氣,采用氣相色譜儀分析甲烷的含量,并檢查出水的DO、pH值、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮.待反應器運行穩定時,通過掃描電子顯微鏡分析微生物的形態,并對反應器中的微生物開展16S rRNA高通量測序分析.

1.4 分析方法

DO和pH值采用HACH便攜式多參數數字化分析儀分析,硝酸鹽氮的分析采用紫外分光光度法(實行)(HJ/T 346-2007),亞硝酸鹽氮的分析采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[14].

甲烷氣體通過氣相色譜儀(GC-2010Plus, SHIMADZU, Japan)進行檢測,采用的色譜柱型號為Rt-Q-BOND (30m × 0.53mm × 20μm),配置TCD檢測器,采用氮氣作為載氣,總流量為36.9mL/min,進樣量1μL[15].

掃描電子顯微鏡分析(SEM):取適量的生物膜,采用4%的多聚甲醛固定1h后,使用0.9%生理鹽水清洗2次;再依次使用濃度分別為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水處理;然后依次使用濃度分別為50%、70%、90%、95%和100%的叔丁醇進行置換處理;將樣品放在樣品托上鍍金處理200s后,采用掃描電子顯微鏡(S-3400N, Hitachi, Japan)進行觀察并拍照.

16S rRNA高通量測序分析:采集反應器中的微生物,立即在-40℃條件下保存,然后送至微生物分析公司進行16S rRNA基因的V3-V4之間的高變區測序,選用細菌通用引物338F(5’-ACTCCTACGG- GAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGG- GTWTCTAAT-3’).微生物分析公司接收到樣品后,提取微生物的DNA,提取的合格DNA進行PCR擴增和產物純化,擴增反應體系為:5×FastPfu Buffer 4μL,2.5mmol/L dNTPs 2μL,引物(2.5mmol/L)各0.8μL,FastPfu聚合酶0.4μL,BSA 0.2μL,模板DNA 10ng,ddH2O補至20μL.采用ABI GeneAmp? 9700型PCR擴增儀,擴增程序為:95 ℃預變性3min,95 ℃變性30s,55 ℃退火30s,72 ℃延伸45s,27個循環, 72℃延伸10min.擴增結束后,采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,上樣量為3μL.然后對PCR產物進行定量和均一化,構建Illumina平臺文庫,進行Illumina平臺測序,然后對所得到的數據進行生物信息分析,包括OTU聚類、物種注釋及分類、群落組成等分析.

2 結果與討論

2.1 反硝化型甲烷好氧氧化系統構建

系統構建過程中對甲烷的消耗量如圖2所示,在前20d內,系統對甲烷的消耗量呈緩慢增長趨勢,從第21d開始,系統對甲烷的消耗量迅速增加,運行至第37d時,系統對甲烷的消耗量達到30.10%,從第38d開始,系統對甲烷的消耗量趨于穩定,反應器運行第37~98d的甲烷日平均消耗量為35.91%.由此可知,采用gcSBBR構建出甲烷氧化菌系統的時間約為37d,該系統構建時間與Pfluger等[16]的研究結果類似,Pfluger等采用流化床富集培養甲烷氧化菌,當運行至35d時,出現了大量的優勢甲烷氧化菌spp. Strains.

如圖2所示,當進水中硝酸鹽氮的濃度升高至300mg/L[0.15kg/(m3·d)]時,系統對甲烷的日平均消耗量變為41.72%,而進水中硝酸鹽氮的濃度升高至500mg/L[0.25kg/(m3·d)]時,系統對甲烷的日平均消耗量變為44.65%,說明系統的甲烷消耗量隨氮負荷的升高而增加.通過分析系統出水的pH值和DO(表2),發現不同氮負荷條件下的pH值均呈中性,而DO隨氮負荷的升高而有一定程度的降低,主要是由于系統對甲烷的消耗量增加后,在氧化甲烷的過程中消耗了更多的DO.

圖2 甲烷消耗量日變化

表2 系統出水的pH值和DO

不同氮負荷條件下系統出水中的總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮如圖3所示,結果顯示,隨著氮負荷的增加,系統對硝酸鹽氮的去除量逐漸增加,當氮負荷為0.25kg/(m3·d)時,硝酸鹽氮去除量達到333.98mg/L,其最大反硝化速率為167.01mg/(L·d);隨著氮負荷的增加,系統對硝酸鹽氮去除率逐漸降低,當氮負荷為0.075kg/(m3·d)時,硝酸鹽氮去除率達到98.93%,其反硝化速率為74.25mg/(L·d).相關研究如Sun等[17]采用膜生物反應器(MBfR)成功構建出好氧甲烷氧化-脫氮系統,發現進水硝酸鹽氮為30mg/L時,硝酸鹽氮去除率可以達到97%; Kampman等[18]采用膜生物反應器中成功培養出了具有脫氮能力的甲烷氧化菌,實現的最大脫氮容積速率為36mg/(L·d);周祥玉等[19]在序批式反應器研究了微氧條件下氮的去除,發現硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別為3.69mg/(L·d)和18.04mg/(L·d);盧培利等[20]研究了亞硝酸鹽型厭氧甲烷氧化,實現的最大脫氮速率為73.10mg/(L·d).通過對比分析可知,相比已有研究所報道的系統,采用gcSBBR構建出的好氧甲烷氧化菌反硝化系統具有較高的反硝化脫氮速率和硝酸鹽氮去除率,其原因可能為研究所采用的gcSBBR系統提供了一個甲烷與微生物充分接觸的環境,使系統中富集了更多的功能微生物,提高了系統的脫氮速率.此外,系統運行穩定后,出水中存在一定的COD濃度,且不同氮負荷下的COD濃度相差不大,其平均COD濃度為35±4mg/L,說明出水中含有一定濃度的有機物,其原因可能為甲烷被微生物利用過程中產生的中間產物、酶或者脫落的菌體引起.

圖3 不同硝酸鹽氮濃度條件下反應器出水TN、NO3--N和NO2—N

2.2 微生物的形態分析

圖4 生物膜的掃描電子顯微鏡(SEM)分析

由Semrau等[21]對甲烷氧化菌的綜述可知,甲烷氧化菌的細胞形態存在橢圓狀、球狀、桿狀、球桿狀、梭狀、彎曲球狀、棒狀和梨狀等,也有的甲烷氧化菌為絲狀[22].通過掃描電子顯微鏡(SEM)分析反應器中的微生物形態,如圖4所示,系統中的微生物主要以短桿菌(12~18μm)為主,并存在少量的絲狀菌(長150~200μm),在細菌周邊還存在大量似胞外聚合物(EPS)[23]的物質.

2.3 微生物群落結構分析

對反應器中的生物膜進行16S rRNA高通量測序,獲得41685條序列,并按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,得到307個OUT.進一步對OTU代表序列進行分類學分析,共發現30門、112科和156屬.在門水平上(圖5A),主要以變形菌門(Proteobacteria)為主,其相對豐度高達59.47%,變形菌門為革蘭氏陰性細菌的最大的組成部分,早在1994年就有研究學者發現用于水處理的微生物主要為變形菌門[24],且大部分甲烷氧化菌和反硝化細菌均屬于變形菌門.此外,其他的分類主要為疣微菌門(Verrucomicrobia)(11.16%)、擬桿菌門(Bacteroidetes) (11.10%)和螺旋菌門(Spirochaetae) (8.94%).

在科水平上(圖5B),嗜甲基菌科(Methylophilaceae)和甲基球菌科(Methylococcaceae)的相對豐度最高,分別為30.74%和11.70%.其中,甲基球菌科屬于I型甲烷氧化菌[25],具有氧化甲烷的能力,通過產生的酶pMMO或sMMO將甲烷氧化成甲醇[26],甲基球菌科也可直接利用甲醇作為生長基質[27].而嗜甲基菌科是一種甲基營養菌,主要發現于活性污泥、河道和湖泊等,不能直接利用甲烷[28],主要以甲醇和甲基胺類物質為生長基質[29],嗜甲基菌科在系統中大量存在,可能是由于甲烷氧化過程的中間產物主要為甲醇、甲醛、甲酸等有機物[8],Xia等[30]在富集甲烷氧化菌時,分離出的最優勢微生物也屬于嗜甲基菌科,表明甲烷氧化菌氧化甲烷后產生的有機物可被其他微生物利用[31].此外, Kalyuhznaya等[32]研究發現嗜甲基菌科在湖泊沉積物的反硝化脫氮過程中具有一定的作用.其他相對豐度較高的為FukuN18淡水組(FukuN18_ freshwater_group)(10.93%)、細螺旋體科(Leptospiraceae) (5.68%)、多囊粘菌科(Polyangiaceae) (4.46%)和腐螺旋菌科(Saprospiraceae)(3.89%).其中豐度較高的FukuN18淡水組(FukuN18_freshwater_ group)被廣泛發現存在于湖、河的底泥中[33-34],該類微生物還不能進行純培養,其生存環境中主要富含腐殖酸等有機物, FukuN18淡水組可能主要以甲烷氧化菌產生的中間產物為營養物質.

在屬水平上(圖6),甲烷氧化菌屬包括(10.49%)、(0.35%)、(0.34%)和_ unclassified (0.53%)[25],其中的相對豐度最高, 是該系統中的主要甲烷氧化菌, 屬于甲基球菌科(),其形態為桿狀或球狀,僅能產生pMMO,此外,也只能產生pMMO,而可以產生sMMO和pMMO[21],說明系統中起主要作用的酶為pMMO.此外,系統中的反硝化菌屬包括(1.21%)、(0.76%)、(0.052%)、(0.017%)和(0.014%)[35],其中常見于城鎮污水處理廠的活性污泥中,可利用硝酸鹽和有機物作為營養物質,將化合態的氮還原成N2O和N2[36].是氫營養型反硝化細菌,存在于污水處理廠活性污泥[37]、地下水環境[38]和試驗裝置[39],由于和的豐度最高,說明這兩類微生物是該系統的主要反硝化細菌.

此外,屬于嗜甲基菌科的主要為_ uncultured(30.40%)和(0.34%)[28],這兩類微生物豐度相對較高的原因可能為系統中甲烷氧化過程中產生了大量含甲基的中間產物,也間接說明系統進氣中甲烷比例偏高.

由上述可知,系統中同時存在大量好氧甲烷氧化菌和反硝化菌,豐度最大的甲烷氧化菌為,豐度較多的反硝化菌為和,說明這3類微生物是系統中最主要的功能微生物.系統對氮的去除是由好氧甲烷氧化菌與反硝化菌協同實現.

圖6 屬水平上的微生物分類

3 結論

3.1 采用氣體循環序批式生物膜反應器(gcSBBR)構建出反硝化型甲烷好氧氧化系統,實現較高的反硝化脫氮速率(74.25mg/L·d)和硝酸鹽氮去除率(98.93%),并考察了不同氮負荷對脫氮效率和甲烷消耗量的影響.

3.2 掃描電子顯微鏡(SEM)分析結果顯示,反應器中的微生物主要以短桿菌為主,并存在少量的絲狀菌.

3.3 高通量測序結果顯示,系統中起主要作用的甲烷氧化菌為,主要的反硝化菌為和. 系統對氮的去除是由好氧甲烷氧化菌與反硝化菌協同實現.

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LI Yan-cheng*, YANG Ya-nan, LIU Deng-ping, LI Lei, LI Jiang

(College of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)., 2019,39(10)：4387~4393

An aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME-D) was constructed using a gas circulation sequencing batch biofilm reactor (gcSBBR), and nitrogen loading in influent was observed. It was found that the removal rate of nitrate nitrogen reached 98.93% and the denitrification rate 74.25mg/(L·d) when the nitrogen load was 0.075kg/(m3·d), and the average daily consumption of methane was 35.91% (at the initial stage: 50%). According to scanning electron microscopy (SEM) results, microorganisms in the system were mainly(12~18μm), dotted with a few filamentous bacteria (150~200μm). The high-throughput sequencing of 16S rRNA indicated that methanotroph were,and, the denitrifying bacteria,,,and, and the main functional bacteria,andin this system. Nitrogen was removed by the synergism of aerobic methanotroph and denitrifying bacteria. In addition, a large volume of(30.4%), which utilized methanol and methylamine as growth substrates, was found.

An aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME-D)；methanotroph；denitrification；gcSBBR；functional microorganisms

X172

A

1000-6923(2019)10-4387-07

李彥澄(1989-),男,重慶人,講師,博士,主要從事廢水處理理論與技術方向研究.發表論文5篇.

2019-03-26

貴州省科技計劃項目(黔科合基礎[2019]1079號);貴州省教育廳青年科技人才成長項目(黔教合KY字[2018]118);貴州大學培育項目(黔科合平臺人才[2017]5788)

* 責任作者, 講師, flywithwin08@163.com