高艷娟,岳秀萍,段燕青,張智春,張 瀟,羅艷紅
厭氧反硝化產甲烷體系中喹啉與吲哚共基質的降解特性
高艷娟,岳秀萍*,段燕青,張智春,張 瀟,羅艷紅
(太原理工大學環境科學與工程學院,山西 太原 030024)
研究了厭氧反硝化產甲烷體系中,典型含氮雜環化合物喹啉、吲哚作為共基質碳源,厭氧生物對二者的降解特性,及群落分析.結果表明:在共基質條件下,喹啉的存在對吲哚的生物降解有抑制作用,且抑制隨喹啉濃度的升高而升高;吲哚的存在對喹啉的生物降解有促進作用,但吲哚濃度過高(150mg/L)抑制了喹啉的降解;喹啉、吲哚共基質時,二者的降解都遵循零級反應動力學;通過GC-MS分析,喹啉的主要中間代謝產物分別為2(1H)喹諾酮與8-羥基-2(1H)喹諾酮;吲哚的主要代謝產物為2-吲哚酮與靛紅;通過高通量測序對共基質體系的微生物群落進行分析,發現厭氧功能菌群得到富集,細菌菌門以變形菌門Proteobacteria為主,菌綱以Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria為主,菌屬以,,,和為主.
厭氧;反硝化產甲烷;共基質;中間產物;微生物群落
含氮雜環化合物普遍存在于焦化廢水、制藥廢水、染料廢水和農藥廢水中,具有致突變性,致癌性,致畸性等特點,是一種難降解的有毒有機污染物[1],對其無害化處理非常難,如何使其被微生物利用,降低毒性,解決出水水質多年來難以達標的難題,一直是工業廢水處理的熱點. 當前,關于含氮雜環化合物的處理方法主要有物理化學法和生物法.物理化學法的成本過高,且有些方法會造成二次污染,不適用于大量廢水的處理[2].生物法是利用污泥中的微生物進行降解,其成本低、管理方便及對有機物可有效利用[3],其中生物降解中的厭氧耦合反硝化產甲烷技術由于其較高的降解率,對含氮雜環化合物的高效處理,且可以在單一反應器內實現同時除碳脫氮,具有節約成本,能源回收等優點日益被人們關注[4].
喹啉、吲哚作為典型的含氮雜環化合物,已經引起了廣泛關注[1,5].Berry等[6-7]研究了厭氧反硝化情況下,含氮雜環化合物的生物降解特性,揭示了雜環化合物的降解途徑.Li等[8]研究了喹啉、吲哚單基質在厭氧反硝化下的降解特性,發現降解速率為吡啶>吲哚>喹啉.國內外大部分研究都是用喹啉、吲哚作為單獨碳源,但在實際廢水中,含氮雜環化合物通常是以共基質的狀態存在的,了解共基質體系中的降解十分重要.Li等[9]研究了在缺氧反應器中,利用活性污泥法,在共基質條件下,吡啶對吲哚的降解具有促進作用.Zhao等[10]利用活性炭的吸附,分析了苯酚與吲哚共基質的降解特征,發現苯酚促進了吲哚的降解.但有關喹啉、吲哚共基質間的共代謝作用、兩者降解過程中的相互影響研究報導甚少,且在共基質體系中代謝產物的轉化、微生物群落結構的特征亟待研究.
因此,本文在厭氧反硝化產甲烷體系中,選取喹啉與吲哚共基質作為碳源與電子供體,NO3?-N作為電子受體,考察喹啉、吲哚在共基質條件下的降解特性和降解動力學特征,對中間降解產物進行分析,且利用高通量技術研究微生物菌群群落特征,以期為基于厭氧反硝化產甲烷技術在降解含氮雜環化合物的實際應用提供理論依據.
實驗采用序批式有機玻璃反應器,容積為500mL,上部設有取樣口,取樣口用止水夾使其密封.反應器放入恒溫搖床培養箱中,進行恒溫培養,搖床溫度為35℃,轉速為40r/min.取樣間隔時間為1d,每次取上清液5mL,以轉速10000r/min離心10min后測定喹啉、吲哚的濃度.
實驗接種污泥取自穩定運行的焦化廢水廠厭氧段污泥(MLVSS=3000g/L),對接種污泥進行預處理,先曝氣1h以上,再用蒸餾水反復沖洗污泥,將污泥中的雜質、無機物與有機物去除干凈,再用N2曝氣20min,去除污泥中的溶解氧,使ORP低于-120mV以下.預處理完后,將污泥與配水以1:3的比例加入到反應器中,再用N2曝氣10min,去除溶液中的氧氣.
實驗配水采用人工配水,以喹啉、吲哚作為共同碳源,分2個實驗組,第一實驗組吲哚濃度不變(150mg/L),喹啉濃度遞增:0,50,100,150mg/L;第二個實驗組喹啉濃度不變(150mg/L), 吲哚濃度遞增:0,50,100,150mg/L.每個小組設置3個平行.以NaNO3為氮源,同時添加微生物生長所必需的微量元素與常量元素.固定NaNO3濃度為30mg/L,投加常量元素KH2PO4、CaCl2、MgSO4,投加量按N:P: Ca:Mg=28:6:1:1[8];投加微量元素的組成與含量(g/L): FeCl2?4H2O(1.422),ZnSO4?7H2O(0.23), CuSO4?5H2O (0.39),CoCl2?6H2O(0.05),NaMoO4(0.23),NiCl2?6H2O (0.081),Na2SeO3(0.011), H3BO4(0.02), EDTA(5), MnCl2?4H2O(0.2).維生素的組成與含量(g/L):生物素(2.00),硫胺素(5.00),鹽酸吡哆醇(10.00),D-泛鈣酸(5.00),硫辛酸(5.00),葉酸(2.00),核黃素(5.00),煙酸(5.00),對氨基苯甲酸(5.00), 維生素B12(0.10).溶液的初始pH用1mol/L NaOH 溶液和 ( 1+9) HCl調節到7.0.
1.2.1 污泥的馴化與測量指標 接種污泥在厭氧反應器中,經過60d的馴化培養,每間隔7d換1次水,使喹啉、吲哚的降解率達到90%以上,反應體系基本到穩定狀態.此后進行喹啉、吲哚共基質的降解研究.喹啉、吲哚的測量用液相色譜(HPLC),流動向為甲醇與水(60:40),流動速率為1mL/min,喹啉的測量波長為313nm,吲哚的測量波長為270nm;喹啉的代謝產物2(1H)喹諾酮的測量波長為276nm; 吲哚代謝產物2-吲哚酮的檢測波長是247nm.本實驗所用的藥品均為可購買的分析純藥品.
1.2.2 高通量群落分析 厭氧反硝化產甲烷污泥對喹啉、吲哚的去除率達到100%后,取接種污泥樣品(S0),共基質實驗組中污泥樣品(S1)進行高通量微生物群落分析.污泥樣品以12000r/min離心10min,置于-20℃保存以備DNA提取.DNA的提取與PCR的擴增均通過上海生工技術公司進行,方法按照之前報道的文章[11],細菌引物為341F (5′-CCCTACA- CGACGCTC-TTCCGATCTG-3′) and 805R(5′-GA- CTGGAGTTCCTTGGCACC-CGAGAATTCCA-3′).
1.2.3 中間代謝產物分析 采用GC-MS技術分析吲哚、喹啉降解過程中的代謝產物.GC-MS色譜柱為石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm),GC-MS分析條件:載氣為氦氣,流速為1.0mL/min;進樣口溫度為310℃,采用程序升溫,氣化室溫度為100℃保持1min,再以5℃/min 增到210保持2min,采集模式采用全掃檢測模式,范圍為50~600.
在厭氧反硝化產甲烷體系中,吲哚與喹啉共基質時,兩物質均能被很好地降解,吲哚(150mg/L)隨喹啉濃度變化(0,50,100,150mg/L)的生物降解情況如圖1(a).由圖1可知,吲哚單基質時,其在48h內降解完,降解率達到100%;共基質時,當喹啉濃度從50mg/L升高到150mg/L,吲哚的降解率從100%降低到92.8%,降解時間從72h 延長到96h.分析得隨著喹啉濃度的提高,喹啉對吲哚的降解產生抑制作用,且濃度越高,抑制作用越強,這是由于喹啉的毒性較大[12],喹啉的存在對微生物產生毒性,減弱了菌群對吲哚的利用.

喹啉(150mg/L)隨吲哚濃度變化(0,50,100, 150mg/L)的生物降解情況如圖1(b).分析圖1(b)可知,喹啉單基質時,其在72h降解完,降解率達100%;共基質時,吲哚濃度為50,100mg/L,喹啉降解時間減少到60、48h,而吲哚為150mg/L時,喹啉降解時間延長到84h.分析得當吲哚低于100mg/L,對喹啉的降解有促進作用,且促進作用隨濃度的升高而增大,這是由于吲哚的降解速率較快[8],吲哚降解過程中,促進了微生物的新陳代謝,增加了生物量,致使喹啉降解速率加快;反之達到150mg/L時,吲哚對喹啉的降解產生抑制,這由于吲哚過量時,其毒性變大,影響了微生物的活性,降低了喹啉的降解速率.
喹啉與吲哚共基質時的降解速率按零級反應進行曲線擬合,結果見表1、2.從表中可以看出,兩者生物降解都遵循零級反應動力學.在表1中,吲哚單基質時,反應速率常數為3.23mg/(L·h),加入50,100, 150mg/L喹啉后,反應速率分別降低到2.31,1.72, 1.43mg/(L·h),進一步說明了在共基質中,喹啉對吲哚的降解有抑制作用,且這種抑制作用隨喹啉投加量的增加而增大.在表2中,喹啉單基質時,反應速率常數為2.32mg/(L·h),而加入50,100mg/L吲哚后,喹啉降解速率加快,反應速率常數顯著增加,升高到2.69, 3.19mg/(L·h),說明了吲哚的存在,對喹啉的降解有促進作用;但吲哚濃度升高到150mg/L,喹啉的反應速率常數為1.92mg/(L·h),反映了吲哚濃度過高,促進作用消失,對喹啉的降解產生了抑制,這是由于吲哚降解提高了的生物量產生對喹啉降解的促進作用,小于過高濃度吲哚對微生物的毒性的抑制作用,導致喹啉降解減慢.結果與之前研究類似,苯酚濃度的增長(100~200mg/L)促進了吲哚中間產物的形成,但是由于苯酚的毒性,過高濃度的苯酚(>200mg/L)反而抑制了吲哚中間產物的產生[13].

表1 吲哚降解隨喹啉濃度變化的動力學方程

表2 喹啉降解隨吲哚濃度變化的動力學方程
由GC-MS分析(圖2)可見,在喹啉厭氧降解過程中,·OH攻擊2位生成2(1H)喹諾酮,其繼續被氧化生成8-羥基-2(1H)喹諾酮.此途徑與Shukla報道的喹啉的降解途徑一致[14],隨后氮雜環開環,最后被轉化為二氧化碳和水.吲哚在降解過程中,在C-2位與×OH形成中間產物2-吲哚酮,再羥基化形成靛紅,此途徑與Madsen報道的,厭氧反硝化中吲哚降解途徑相似[15],其隨后羧基化形成鄰氨基苯甲酸,最后轉化成二氧化碳與水.但是本試驗中并未檢測到2,3-二羥基苯丙酸與鄰氨基苯甲酸,可能與化合物自身的不穩定性或者中間代謝產物較快的代謝速率有關.
為了研究共基質下中間產物的代謝情況,選取最初的代謝產物2(1H)喹諾酮與2-吲哚酮,分析二者的代謝情況,見圖3.從圖3(a)可見,吲哚的中間產物2-吲哚酮均先升高后降低,隨著喹啉濃度的增高(0~150mg/L),2-吲哚酮積累量增高且降解時間延長,降解速率逐漸變慢(1.87~0.75mg/(L×h)).說明共基質時,喹啉抑制了吲哚中間產物的形成和轉化.由圖3(b)可見,喹啉的中間代謝產物2(1H)喹諾酮同樣呈現先升高后降低的趨勢,隨著吲哚濃度的增加(0~100mg/L),2(1H)喹諾酮的積累量減少、降解時間縮短及速率加快(1.14~1.45mg/(L×h)),但吲哚增到150mg/L,2(1H)喹諾酮積累量增高,降解速率變慢(0.83mg/(L×h)).說明了適量的吲哚促進了喹啉中間產物的形成和降解,提高了中間產物的代謝速率.

圖2 喹啉與吲哚降解過程過程中72h的GC-MS譜圖

圖3 在厭氧反硝化產甲烷條件下,喹啉與吲哚共基質時中間產物的形成與降解
選取共基質下的厭氧污泥(S1)與接種污泥(S0),進行高通量群落分析,微生物的門、綱、屬結果見圖4.從圖4(a)看出,在厭氧反硝化產甲烷體系中,細菌菌門以變形菌門Proteobacteria為主,這種菌門具有在反硝化過程中,利用硝酸鹽氮為電子受體,降解雜環化合物的功能[16],在共基質污泥體系中, Proteobacteria的相對豐度從32.35%(S0)富集到56.88%(S1),成為喹啉、吲哚共基質體系中優勢菌門.Chloroflexi是綠彎菌門,它是一種厭氧菌,被普遍發現存在于厭氧反硝化產甲烷體系中,在喹啉、吲哚共基質體系中,也占用較高豐度(14.23%).菌門Bacteroidetes是擬桿菌門,研究者發現,擬桿菌門是污水生物處理細菌菌群的重要組成成分[17]; Acidobacteria是酸桿菌門,據報道它是厭氧發酵產甲烷體系中的重要菌群[18],在厭氧反硝化產甲烷共基質體系中,Bacteroidetes和Acidobacteria 相對豐度均分別從S0中4.73%和1.73%升高到S1中5.85%和3.68%,成為重要菌群.Bacteroidetes和Acidobacteria這兩個菌門可以將喹啉、吲哚等難降解的大分子含氮雜環化合物轉化為小分子等易降解有機物,例如乙酸、丙酸、戊酸等,容易被菌種利用,進而進行產甲烷[19].
從圖4(b)中看出,共基質體系中,細菌菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主,這三個菌綱都屬于變形菌門(Proteobacteria).這類型菌群在厭氧污水處理,污染物的降解與厭氧污泥形成的過程中發揮著十分重要的代謝功能,適用于降解多環芳烴等多種有機物的降解[20].菌綱Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的相對豐富均分別從11.4%、8.52%(S0)升高到24.16%、16.69% (S1),說明對比接種污泥,經過長時間馴化,共基質體系中降解喹啉、吲哚的功能菌群得到富集.
對細菌的菌屬做了進一步的分析,結果見圖4(c).屬于菌綱Gammaproteobacteria,它具有一定的反硝化能力,可將硝酸鹽氮還原為氮氣,并且在厭氧污泥中礦化芳香族化合物的功能[21-22],常存在于降解含氮雜環化合物的厭氧污泥中.據報道,在合適的生存體系中,可以通過IifC酶對吲哚、喹啉進行氧化和降解[21].因此,菌屬成為共基質體系中相對豐度最高的功能菌屬,從S0中2.57%升高到S1中15.73%.的相對豐度從0.02%(S0)升高到5.06%(S1),研究發現具有一定的反硝化功能,被發現存在于吲哚和喹啉的降解污泥中,可以在反硝化過程中利用硝酸鹽氮作為電子受體,氧化有機物[23].菌屬的相對豐度升高到3.26%(S1),它常存在于厭氧有機物降解的污泥中,具有反硝化功能[24],成為共基質降解的重要菌屬.菌屬普遍存在于厭氧發酵污泥中,研究發現它是一種H2利用細菌,可以利用丙酮酸、乳酸、甲酸鹽和H2作為電子供體,在發酵反應中產甲烷[25].菌屬從0.34%(S0)增高到1.65% (S1),反映了它利用喹啉、吲哚降解產生的小分子物質,進行發酵反應,產甲烷的特性.其他功能菌屬如:,等,都具有一定的反硝化,降解有機物的功能[26],在共基質群落中占有十分重要的作用.

(a) 菌門;(b) 菌綱;(c) 菌屬
綜上所述,在厭氧反硝化產甲烷體系中,喹啉、吲哚共基質條件下,其微生物種群分屬于菌門Proteobacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes和Acidobacteria;菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主;功能菌屬中最重要的是、、和,其他功能菌屬也在喹啉、吲哚降解中發揮著重要作用.
3.1 在厭氧反硝化產甲烷共基質體系中,喹啉對吲哚的降解產生抑制作用,濃度越高,抑制作用越強;吲哚(<100mg/L)對喹啉的降解有一定的促進作用,但達到150mg/L后,促進作用消失.
3.2 喹啉、吲哚共基質下的降解均符合零級反應動力學.
3.3 共基質時喹啉的主要代謝產物為2(1H)喹諾酮與8-羥基-2(1H)喹諾酮;吲哚的主要代謝產物為2-吲哚酮與靛紅.
3.4 喹啉、吲哚共基質時,微生物菌門主要以: Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria為主菌綱以Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria為主,菌屬以、、和為主.
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Degradation of quinoline and indole co-substrate under anaerobic denitrification and methanogenesis conditions.
GAO Yan-juan, YUE Xiu-ping*, DUAN Yan-qing, ZHANG Zhi-chun, ZHANG Xiao, LUO Yan-hong
(College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China).e, 2019,39(10):4150~4156
Bath experimrnts were conducted to study the degradation characteristics and microbial community of quinoline and indoles co-substrate under anaerobic denitrification and methanogenesis conditions, which were known as typical N-heterocyclic compounds.The results showed that the presence of quinolone could inhibit the degradation of indole, and the inhibition effect was enhanced with the increase of quinoline concentration; the presence of indole could promote the degradation of quinoline, but the high concentration of indole (150mg/L) inhibited the degradation of quinolone; the kinetics of quinoline and indole was followed the zero-order kinetics model; through GC-MS analyses, the intermediate metabolites of quinoline were 2-hydroxyquinoline and 2,8-dihydroxyquinoline; and metabolites of indole were oxindole and isatin. The high-throughput sequencing technology was used to analyze the microbial community structure, and results indicated that the functional bacterial were enriched in the anaerobic denitrification and methanogenesis system. The bacterial phylum was Proteobacteria, the dominant classes were Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria, and the dominant genera were,,,and.
anaerobic;denitrification and methanogenesis;co-substrate;intermediate metabolites;microbial communit
X703
A
1000-6923(2019)10-4150-07
高艷娟(1988-),女,山西呂梁人,博士,主要從事水污染控制與研究方面研究.發表論文1篇.
2019-03-27
國家自然科學基金資助項目(51378330)
* 責任作者, 教授, yuexiuping@tyut.edu.cn