液態法大曲酒發酵過程中高級醇影響因素的研究

王亞平，邢 爽，孫中貫，肖冬光

(教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

高級醇是指具有3 個碳鏈以上的一價醇類，包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇等[1].酒中含適量的高級醇，具有使酒口感協調、酒體豐滿的作用；過量則帶有苦澀怪味，給酒帶來不良影響[2].并且，高級醇在人體內的代謝速度較慢，作用時間較長，當高級醇含量過高時就會造成飲后“上頭”[3].白酒中的高級醇主要通過兩個途徑生成：一是酵母以氨基酸為基質的降解代謝路徑，氨基酸經脫氨、脫羧生成比氨基酸少一個碳原子的高級醇[4]，在培養基中氨基酸過量時較易生成；二是酵母以糖為基質的合成代謝路徑時，生成α-酮酸，經脫羧、還原生成高級醇[5]，在培養基中可利用氮源缺乏時較易生成.

在傳統液態法白酒發酵過程中，由于采用純種酒母和糖化酶為糖化發酵劑，釀酒原料、釀造工藝及微生物種類單一，微環境體系相對均一化，導致液態法白酒發酵體系中可利用氮源含量較低[6]，因而傳統液態法白酒大多通過糖代謝途徑生成高級醇，其高級醇生成量比固態法白酒高兩倍左右[7]，且液態法白酒的風味物質豐富性不如固態法白酒，酒體相對單薄，缺乏固態法發酵白酒的自然感.固態法白酒存在的主要問題是需要手工操作、勞動強度大、生產效率低；而液態法白酒的高生產效率使之成為了科技工作者研究的目標.

針對液態法白酒的酒質問題，陳峻[8]提出了通過精選原料、蒸煮排雜、選擇優良菌種發酵等技術措施.張昊等[9]在研究控制液態法白酒質量的技術中，認為除對原料品質的要求及控制蒸煮過程外，延長發酵時間可以增加發酵醪中的酸酯成分.關于液態法白酒中風味物質成分單一這一問題，行業內做了很多研究，通過固液勾兌等方法基本上解決了液態法白酒口味寡淡問題，但如何降低液態法白酒中高級醇的含量，仍然是行業內存在的主要問題.

為了實現白酒生產優質高效的目的，本文在傳統液態法白酒的基礎上，采用純種釀酒酵母與酶制劑協同傳統大曲糖化發酵的液態法大曲酒生產工藝，既保留固態法大曲酒多菌落發酵的特征，又彌補了大曲中釀酒酵母和某些釀酒酶系活性的不足[10].從釀酒原料、酵母菌種、接種量、酶制劑用量等角度，研究影響液態法大曲酒高級醇含量的主要因素，以及傳統大曲與酵母、酶制劑協同發酵作用對高級醇的影響，優化液態法大曲白酒發酵工藝，為液態法大曲酒生產中高級醇含量的控制提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，均為工業生產用優良菌株，工業發酵微生物教育部重點實驗室保存.

糯高粱、粳高粱、玉米，市售；清香大曲(含粗淀粉50.05%、糖化力792 mg/(g·h)、液化力0.93 g/(g·h)、水分14.23%)，北京紅星股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶(2×104U/mL)、糖化酶(1×105U/mL)、酸性蛋白酶(5×104U/g)，諾維信(中國)生物技術有限公司.

UV-5200 型紫外-可見分光光度計、手持式糖度計、Agilent 7890B 型氣相色譜儀、Agilent HPINNOWAX 型色譜柱(30 m×320μm×0.25μm)，美國安捷倫科技有限公司.

1.2 測定方法

采用直接干燥法按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準·食品中水分的測定》進行水分的測定.采用杜馬斯燃燒法按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準·食品中蛋白質的測定》進行粗蛋白的測定.采用索氏抽提法按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準·食品中脂肪的測定》進行粗脂肪的測定.采用酸水解法按照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準·食品中淀粉的測定》進行總淀粉的測定.采用分光光度法按照GB/T 15683—2008《大米·直鏈淀粉含量的測定》進行直鏈淀粉的測定.采用分光光度法按照GB/T 15686—2008《高粱·單寧含量的測定》進行單寧的測定.酒度的測定參見文獻[11]，采用酒精計法進行測定.采用血球計數板法測定酵母細胞數.揮發酸和總酯采用酸堿滴定指示劑法[12]進行測定.還原糖和殘淀粉采用斐林試劑法[13]進行測定.高級醇采用氣相色譜法[14]進行測定.淀粉出酒率按照參考文獻[15]計算.

1.3 種子培養

一級種子：從試管斜面接種一環酵母菌于裝有5 mL 玉米糖化醪培養基的20 mL 試管中，30 ℃靜置培養24 h.

二級種子：將一級種子轉接入裝有100 mL 玉米糖化醪培養基的250 mL 三角瓶中，30 ℃靜置培養16 h.

1.4 發酵工藝實驗

原料粉碎，料液比為1∶3，加液化酶3 U/g 原料，在80～90 ℃下不斷攪拌，液化1 h；待醪液冷卻至60 ℃，加糖化酶60 U/g 原料并不斷攪拌，糖化30 min；醪液冷卻至40 ℃時，加酸性蛋白酶4 U/g 原料，并不斷攪拌，作用15 min；醪液冷卻至30 ℃時，根據各個實驗的設置，接入二級種子酵母菌液和大曲；加水至發酵液總重為200 g，總體積約為170 mL，用250 mL 三角瓶進行發酵實驗，于30 ℃培養箱靜置發酵5 d，取樣分析，每個實驗重復3 次[16].

1.4.1 不同原料對液態發酵大曲酒的影響

分別制備粳高粱、糯高粱和玉米發酵培養基.加原料用量10%的清香大曲，接種釀酒酵母A-2 種子培養液6×106mL-1，30 ℃靜置發酵5 d.

1.4.2 酵母菌種對液態發酵大曲酒的影響

以粳高粱為原料，比較酵母菌種A-1、A-2、A-3、A-4、A-5 的發酵效果.

選定釀酒酵母A-2 為菌種，分別進行不同接種量(2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106mL-1)的實驗.

1.4.3 酶制劑對液態發酵大曲酒的影響

在1.4.2 選定的菌種和接種量的基礎上，進行不同糖化酶用量(0、45、60、70、90、105 U/g)和不同酸性蛋白酶用量(0、2、4、6、8、10 U/g)的實驗.

1.4.4 大曲用量對液態發酵大曲酒的影響

在以上實驗選定的液化酶添加量3 U/g、糖化酶添加量60 U/g、酸性蛋白酶添加量4 U/g 的基礎上，進行不同大曲用量(0、5%、10%、20%、30%、40%)的實驗.

1.5 數據統計分析

所有實驗均設置3 個平行樣.采用Excel 2016統計分析軟件對實驗數據進行方差分析，數據表示為平均值±標準差，并使用t 檢驗對實驗組與對照組之間差異進行顯著性分析，*表示有顯著差異(P＜0.05)，**表示有極顯著差異(P＜0.01).

2 結果與分析

2.1 不同原料對液態發酵大曲酒的影響

不同原料的理化性質及對白酒液態發酵的影響見表1 和表2.糯高粱組為對照組，結果表明：就發酵酒度來看，糯高粱原料最低，粳高粱與玉米原料相差不大；從揮發酸含量來看，糯高粱原料最高，粳高粱原料次之，玉米原料最低；3 種原料發酵的總酯含量無明顯差別；就高級醇含量來看，粳高粱原料、糯高粱與玉米原料相差不大；由于不同釀酒原料的品質差異，如單寧含量、支鏈淀粉與直鏈淀粉含量不同等因素造成白酒液態法發酵品質的差異.綜合比較認為，粳高粱原料更適合液態法大曲酒生產.

表1 不同原料的理化性質Tab.1 Physical and chemical properties of different raw materials

表2 不同原料對液態發酵大曲酒的影響Tab.2 Effect of different materials on liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2 酵母菌種對液態發酵大曲酒的影響

2.2.1 菌種

酵母菌種對液態發酵大曲酒理化指標的影響見表3，對主要高級醇含量的影響見圖1.結果表明：5株酵母菌種發酵酒度無明顯差別；揮發酸含量菌種A-1 最高，A-4 最低，其余3 株產酸相差不大；從總酯含量看，A-2、A-5 產酯能力較強，其余3 株相對較弱；從高級醇產量看，A-3 最高，A-2 最低.從圖1 可以看出，與A-1 相比，A-2、A-3、A-4 的異戊醇含量有極顯著差異.綜上所述，在相同工藝條件下，來源不同的釀酒酵母由于其遺傳多樣性在酒度、揮發酸、總酯和總高級醇含量上有所不同.綜合比較，釀酒酵母A-2 產高級醇總量最低、產酯能力較強、產揮發酸相對較少，比較適合用于液態法大曲酒生產用菌株，因此下面的實驗以釀酒酵母A2 為菌種.

表3 酵母菌種對液態發酵大曲酒的影響Tab.3 Effect of yeast strain on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖1 酵母菌種對液態發酵大曲酒中高級醇的影響Fig.1 Effect of yeast strain on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2.2 酵母接種量

酵母接種量對液態發酵大曲酒酒度的影響見表4，對主要高級醇含量的影響見圖2.

表4 酵母接種量對液態發酵大曲酒的影響Tab.4 Effect of yeast inoculation concentration on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖2 酵母接種量對液態發酵大曲酒中高級醇的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation concentration on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從發酵結果看，隨著酵母接種量從2×106mL-1增加至6×106mL-1，酒度明顯增加；繼續增大接種量，酒度增加不明顯.酵母接種量為2×106mL-1時總高級醇含量最低，接種量在4×106mL-1以上時總高級醇含量幾乎不再增加.從各高級醇的結果來看，異戊醇先升高后降低，其余3 種高級醇隨著接種量的增加，含量逐漸增加.綜合考慮酒度和高級醇含量酵母接種量以6×106mL-1為宜.

2.3 酶制劑用量對液態發酵大曲酒的影響

2.3.1 糖化酶用量

糖化酶用量對液態發酵大曲酒的影響見表5，對主要高級醇含量的影響如圖3 所示.

表5 糖化酶用量對液態發酵大曲酒的影響Tab.5 Effect of the amount of glucoamylase on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖3 糖化酶用量對液態發酵大曲酒中高級醇的影響Fig.3 Effect of glucoamylase on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從酒度來看，當糖化酶的用量由0 U/g 增加到45 U/g 時，酒度從(10.37±0.10)%提高到(10.60±0.05)%；從高級醇含量的變化來看，隨著糖化酶用量增加，正丙醇、異丁醇先降低后穩定，異戊醇逐漸增多，苯乙醇含量變化較小.總高級醇含量呈先下降后升高的趨勢，當糖化酶添加量為60 U/g 時，高級醇總量最低，為(429.58±5.12)mg/L.這主要原因是適量的糖化酶用量，使淀粉的水解與糖的發酵達到動態平衡，而適量的糖濃度有利于酵母的酒精發酵，在此條件下高級醇的生成量減少.由此可見，通過調節糖化酶的用量，協調淀粉糖化與酵母酒精發酵的平衡，可適當降低液態法大曲酒中高級醇的含量.

2.3.2 酸性蛋白酶用量

酸性蛋白酶用量對發酵培養基中α-氨基氮含量的影響見表6，對液態發酵大曲酒的影響見表7，對主要高級醇含量的影響如圖4 所示.

表6 酸性蛋白酶對發酵培養基中α-氨基氮含量的影響Tab.6 Effect of the amount of acid protease on the content of alpha amino nitrogen in fermentation medium

表7 酸性蛋白酶用量對液態發酵大曲酒的影響Tab.7 Effect of the amount of acid protease on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖4 酸性蛋白酶用量對液態發酵大曲酒中高級醇的影響Fig.4 Effect of the amount of acid protease on higher alcohol in liquor fermentation of Daqu Baijiu

對照表5、表6 和圖4，隨著酸性蛋白酶用量的增加，培養基中α-氨基氮含量逐漸升高；從酒度看，酸性蛋白酶用量的影響不明顯；從高級醇含量看，隨著酸性蛋白酶用量的增加，高級醇總量和各主要高級醇含量都呈現先降低后升高的趨勢，當酸性蛋白酶用量為4 U/g、培養基中氨基氮含量為(90.08±0.83)mg/L 時，總高級醇含量最低為(431.29±2.93)mg/L.這是因為當培養基中氨基酸充足時，酵母通過氨基酸降解代謝途徑生成較多的高級醇；而在培養基中氨基酸缺少的情況下，酵母通過合成代謝途徑，以糖為基質生成較多的高級醇；當培養基中氨基酸含量和酵母菌的需求量相適應時，高級醇的生成量最低.由此可見，通過調節白酒發酵體系中酸性蛋白酶的用量可適當調節成品白酒中高級醇的含量.

2.4 大曲用量對液態發酵大曲酒的影響

大曲用量對液態發酵大曲酒的影響見表8，對主要高級醇含量的影響如圖5 所示.

表8 大曲用量對液態發酵大曲酒的影響Tab.8 Effect of the amount of Daqu on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖5 大曲用量對液態發酵大曲酒中高級醇的影響Fig.5 Effect of the amount of Daqu on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從酒度和淀粉出酒率看，隨著大曲用量的增加，先升高后逐漸降低.大曲的使用豐富了醪液中的酶系，如纖維素酶可將原料中的纖維素分解為可發酵性糖，適量的蛋白酶可增加發酵液中氨基酸的含量，有利于酵母菌的生長與酒精發酵；但隨著大曲用量的繼續增加，大曲中各種微生物群落的生長和代謝會消耗發酵液中的可發酵性糖，導致酒度和出酒率下降；當大曲用量達40%時，酒度下降達20%左右.從高級醇含量看，隨著大曲用量的增加，高級醇含量明顯下降；當大曲為 40%時，高級醇總量為(207.73±1.03)mg/L，與不加大曲的對照相比(519.07±11.47 mg/L)，高級醇含量降低了59.98%.大曲的使用增加了發酵醪液中的微生物種類，這些微生物與酵母對營養物質的競爭性利用，使酵母的生長代謝受到一定抑制，從而大大降低高級醇的生成量.可見通過調節大曲用量，協調傳統大曲中的微生物與釀酒酵母的相互作用，可以有效地降低液態法大曲酒中高級醇的含量.

3 結 語

從釀酒原料、酵母菌、釀造用酶(糖化酶、酸性蛋白酶)和大曲用量等多個因素的發酵實驗結果看，以粳高粱為原料、釀酒酵母A-2 為菌種，在酵母接種量6×106mL-1、糖化酶用量60 U/g、酸性蛋白酶用量4 U/g、大曲用量 40%的條件下，高級醇含量為(207.73±1.03)mg/L，相比初始發酵條件下的高級醇含量(434.62±4.06 mg/L)下降了52.18%，但同時淀粉出酒率下降了24.58%.由此說明采用傳統大曲與純種培養的釀酒酵母和商品酶制劑協同糖化發酵，可有效降低液態法白酒高級醇含量高的問題，這為液態法白酒品質的提高開辟了新的方法.但是，在白酒實際生產中，應綜合考慮出酒率、高級醇含量、產品質量以及生產成本等因素，確定合理大曲用量，將高級醇含量控制在合適的范圍.除大曲用量外，酵母菌種是影響液態法白酒高級醇含量的又一重要因素.本研究所用菌種均為生產上使用的工業菌株，若采用現代分子生物技術對釀酒酵母的高級醇代謝進行改造，即可實現在大曲用量較少的情況下生成適量的高級醇，達到優質高產的目的，這將是我們下一步研究的重點.