新月彎孢霉CICC40301 催化4-烯-3-酮甾體化合物羥基化反應產物的鑒定

李慧杰，李 明，金 鵬，郭文麗，王 雪，王正祥，劉曉光

(1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津科技大學化工與材料學院，天津 300457)

甾體化合物具有廣泛的藥理和生理活性，在抗炎、抗腫瘤、調節性功能和生育控制等方面具有極其重要的作用[1-2].天然的甾體化合物往往藥理活性較低，在甾體藥物的特定位點引入羥基可以顯著提高其藥理與生理活性[3-4].甾體化合物結構復雜且含有多個非對稱中心，用化學合成法在甾體化合物的關鍵位點引入氧原子非常困難，涉及多步復雜的保護和去保護反應，如在黃體酮的C11α-羥基引入羥基需要9 步化學反應，而利用黑根霉(Rhizopus nigricans)轉化可以一步完成C11α-羥化反應生成C11α-羥基黃體酮，得率達到85%[5].由于微生物轉化具有特異性強、效率高、污染低等優點，已廣泛應用于甾體藥物羥基化修飾[6-8].

目前已報道的具有甾體轉化活性的微生物多達1 500 種，但成功應用于工業生產的菌株并不多[4,6].進一步研究開發工業生產菌種對于改進甾體生物轉化效率和拓寬微生物催化在甾體工業中的應用范圍具有重要意義.絲狀真菌新月彎孢霉(Curvularia lunata)在工業上用于C11β 羥化Reichstein S 化合物(RS)，生產具有抗炎活性的氫化可的松[9].C17α-羥基孕酮是合成氫化可的松、潑尼松龍、地塞米松等多種甾體藥物的一個關鍵中間體[10]，而C14α-羥基4AD 是合成抗腫瘤化合物C14α-羥基-3，6，17 三酮的關鍵前體[11].作者在研究新月彎孢霉的甾體底物轉化的過程中發現新月彎孢霉菌株CICC40301 不能轉化RS，但對孕酮、睪酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)都有明顯的轉化活性，通過HPLC、1H NMR、13C NMR 方法確認其相應的主要轉化產物為C17α-羥基孕酮、C15-羥基睪酮和C14α-羥基4AD.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

新月彎孢霉(Curvularia lunata)CICC40301 為本實驗室保存菌株.

1.1.2 試劑

甲醇、石油醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，二甲基亞砜-d6(DMSO-d6)，國藥集團化學試劑有限公司；薄層層析硅膠板，煙臺德信生物科技有限公司.

1.1.3 甾體化合物

孕酮、睪酮和雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)均由北京紫竹藥業有限公司提供.

1.1.4 培養基

PDA 培養基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂粉20，115 ℃滅菌 20 min.

YPD 培養基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖20，115 ℃滅菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 新月彎孢霉的培養及孢子懸浮液的制備

將新月彎孢霉CICC40301 孢子接種于PDA 斜面培養基，28 ℃恒溫培養2～4 d.待孢子成熟后，將長有新月彎孢霉孢子的PDA 斜面用無菌水洗下分生孢子，血球計數板計數，再用無菌水調節孢子懸液至濃度為107mL-1，備用.

1.2.2 新月彎孢霉CICC40301 菌絲的培養

吸取1 mL 濃度為107mL-1的孢子懸液接入50 mL 的 YPD 液體培養基中，放入恒溫搖床180 r/min、28 ℃培養至36 h.

1.2.3 底物的轉化

將新月彎孢霉培養36 h 后，將甾體底物孕酮、睪酮和4AD 通過球磨機研磨，使其顆粒直徑為10～15μm.投入甾體底物使其終質量濃度為2 g/L，并添加 1%的 N，N-二甲基酰胺(DMF)作為助溶劑，28 ℃、180 r/min 振蕩培養48 h 后取樣.

1.2.4 高效液相色譜檢測分析

取甾體底物孕酮、睪酮和4AD 及其對應的轉化產物樣品加入到1.5 mL EP 管中，加入600μL 80%乙腈完全溶解后，經0.22μm 膜過濾至液相小瓶中，備用.

色譜條件：色譜柱為C18 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，乙腈-水(體積比為80∶20)為流動相，流量0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10μL，采用紫外檢測器，檢測波長240 nm.本方法中所用乙腈為色譜純，水為去離子水經過濾超聲處理.

1.2.5 核磁共振檢測分析

樣品處理：取100 mL 底物發酵液中的30 mL 于50 mL 離心管，用6 mL 乙酸乙酯萃取，劇烈震蕩，使其與發酵液充分混合，12 000 r/min 離心5 min，分別萃取3 次，合并有機相.

產物制備：取有機相在層析板上點樣.在展開前用展開劑飽和層析缸30 min.將點有樣品的硅膠板放入裝有展開劑的層析缸中加蓋、密封，待展開劑前沿快到頂端時，取出點樣板后烘干.采用紫外檢測儀觀察層析斑點的顏色和大小.孕酮轉化產物的展開劑為V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)＝5.5∶3.5∶1；4AD、睪酮轉化產物的展開劑為V(二氯甲烷)∶V(石油醚)∶V(甲醇)∶V(水)＝385∶60∶30∶2.

通過刮板得到產物，加二氯甲烷和甲醇混合液(二氯甲烷與甲醇體積比為5∶1)10 mL 溶解，混勻.將得到的溶液加入到50 mL 的圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去二氯甲烷和甲醇得到產物，之后向產物中加入DMSO 將其溶解，將溶解的溶液加入到核磁管中進行檢測分析.

核磁共振條件：1H NMR、13C NMR 譜分別用400 MHz 和101 MHz 記錄，布魯克Ascend 400 系列核磁共振儀使用DMSO-d6作為溶劑.

2 結果與分析

2.1 新月彎孢霉孕酮轉化產物的分析

2.1.1 孕酮轉化產物HPLC 分析

通過刮板分離得到轉化產物，HPLC 分析(圖1)顯示，孕酮底物出峰時間為6.760 min，孕酮兩種轉化產物的出峰時間分別為3.032 min 和3.686 min，其中一種孕酮轉化產物純化之后的出峰時間為3.029 min，并且其轉化率為22.2%.

2.1.2 孕酮轉化產物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.623(s，1H，C-4H)，4.011(s，1H，OH)，0.657(s，3H，H-18)，1.139(s，3H，H-19).13C NMR(101，MHz，DMSO-d6)δ 210.37(C-20)，198.54(C-3)，171.63(C-5)，123.40(C-4)，83.60(C-17)，59.57(C-14)，48.15(C-9)，46.26(C-13)，38.64(C-10)，38.30(C-12)，35.80(C-8)，34.12(C-1)，32.35(C-2)，32.30(C-6)，31.62(C-7)，30.83(C-21)，27.44(C-15)，21.52(C-16)，20.31(C-11)，17.17(C-19)，17.17(C-18).

圖1 新月彎孢霉CICC40301孕酮轉化產物的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of the progesterone transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.1.3 孕酮轉化產物確認

根據孕酮轉化產物的1H NMR、13C NMR 結果，碳譜中C17 的化學位移從孕酮的63.23 變為83.60，后者與文獻報道C17-羥基孕酮的碳譜數據一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.623，H18＝0.657，H19＝1.139)的化學位移值與文獻報道C17-羥基孕酮的氫譜數據基本一致[13]，鑒于孕酮母核的C17α-H 被OH 取代，故產物確認為C17α-羥基孕酮.

2.2 新月彎孢霉雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉化產物的分析

2.2.1 雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉化產物HPLC分析通過刮板分離得到轉化產物，HPLC 分析(圖2)顯示，4 AD 底物出峰時間為4.434 min，4 AD 兩種轉化產物的出峰時間分別為2.781 min 和3.059 min，其中一種 4 AD 轉化產物純化后的出峰時間為3.059 min，并且其轉化率為45.1%.

圖2 新月彎孢霉CICC40301 4AD轉化產物的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of the 4AD transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.2.2 雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉化產物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.641(s，1H，C-4H)，4.304(s，1H，OH)，0.921(s，3H，H-18)，1.150(s，3H，H-19).13C NMR(101 MHz，DMSOd6)δ218.03(C-17)，197.98(C-3)，170.82(C-5)，123.02(C-4)，78.93(C-14)，52.09(C-13)，46.41(C-9)，38.20(C-10)，37.35(C-12)，35.27(C-1)，33.62(C-2)，32.78(C-6)，31.63(C-7)，28.89(C-8)，25.43(C-15)，24.51(C-16)，18.82(C-11)，17.12(C-19)，16.82(C-18).

2.2.3 4AD 轉化產物確認

根據4AD 轉化產物的 1 H NMR、13C NMR 結果，碳譜中C14 的化學位移從4AD 的51.67 變為78.93，后者與文獻報道C14-羥基4AD 的碳譜數據一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.641，H18＝0.921，H19＝1.150)的化學位移值與文獻報道 C14-羥基4AD 的氫譜數據基本一致[13]，鑒于4AD 母核的C14α-H 被OH 取代，故產物確認為C14α-4AD.

2.3 新月彎孢霉睪酮轉化產物的分析

2.3.1 睪酮轉化產物HPLC 分析

通過刮板分離得到轉化產物，HPLC 分析(圖3)顯示，睪酮底物出峰時間為4.007 min，睪酮轉化產物的出峰時間為2.772 min，純化的睪酮轉化產物出峰時間為2.890 min，并且其轉化率為88.2%.

2.3.2 睪酮轉化產物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.609(s，1H，CH4)，4.240(d，1H，J＝5.2 Hz，OH)，4.227(m，1H，H-15)，0.759(s，3H，H-18)，1.143(s，3H，H-19).13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ198.56(C-3)，171.91(C-5)，123.32(C-4)，81.74(C-17)，77.32(C-15)，46.99(C-9)，46.79(C-14)，39.07(C-13)，38.75(C-10)，35.83(C-1)，34.15(C-2)，32.37(C-6)，32.03(C-7)，29.84(C-8)，28.86(C-12)，26.53(C-16)，19.98(C-11)，17.21(C-19)，15.33(C-18).

圖3 新月彎孢霉CICC40301睪酮轉化產物的HPLC 分析Fig.3 HPLC analysis of the testosterone transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.3.3 睪酮轉化產物確認

根據睪酮轉化產物的1H NMR、13C NMR 結果，碳譜中C15 的化學位移從睪酮的27.43 變為77.32，與文獻報道C15-羥基睪酮的碳譜數據一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.609，H18＝0.759，H19＝1.143)的化學位移值與文獻報道的C15-羥基睪酮氫譜數據基本一致[13]，故產物確認為C15-羥基睪酮.

3 結 論

新月彎孢霉(Curvularia lunata)CICC40301 能夠轉化甾體底物孕酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮和睪酮，利用高效液相色譜(HPLC)和核磁共振方法分析鑒定了相應的主要轉化產物，結果為：C17α-羥基孕酮、C14α-羥基4AD、C15-羥基睪酮.轉化產物C17α-羥基孕酮是用于合成氫化可的松等多種甾體藥物的重要中間體，C14α-羥基4AD 是合成抗腫瘤化合物C14α-羥基-3，6，17 三酮的關鍵前體.