生防菌HFW217的鑒定及其對棉花枯萎病的防治效果

丁建朋，范瑛閣，姚永生

(塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾，843300)

0 引 言

【研究意義】2017年新疆棉花種植面積196.3×104hm2，總產量408.2×104t，分別占全國的60.8%和74.4%[1-2]。由于大面積種植以及多年連作，棉花枯萎病發生日益嚴重，而長期借助多菌靈、百菌清等進行化學防治，致使病原菌抗藥性不斷提高，防控越來越困難，也對環境造成了污染[3-5]，嚴重制約著新疆棉花的可持續發展。篩選對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的微生物，對棉花枯萎病的生物防治具有重要意義[6]。【前人研究進展】生物防治因其對環境友好、人畜安全性高及作用靶標專一性強等優點，是目前生產中較為安全有效的防控措施，利用拮抗微生物進行生物防治符合保護生態環境的需求，為農業有害生物綠色防控和可持續發展提供技術保障[7]。具有拮抗作用的微生物在維持土壤微生物群落結構平衡中起著重要作用，已報道對尖孢鐮刀菌有拮抗作用的微生物主要有木霉菌Trichodermaspp.、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis等[6,8-10]，其中木霉菌防治棉花枯萎病取得了良好的防效。【本研究切入點】應用拮抗微生物對防治病害可有效減少農藥對環境的污染，是極具潛力的發展方向[11-12]。研究分離篩選對棉花枯萎病有抑制作用的微生物，并進行鑒定。【擬解決的關鍵問題】研究以一株南疆半沙漠化、半鹽堿化環境中分離的生防菌HFW217為目標，通過16S rDNA和生理生化方法，對其進行鑒定，并測定其對棉花枯萎病的溫室和田間藥效，可為防控棉花枯萎病的生物農藥開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 生防菌

生防菌HFW217，從阿拉爾周邊長勢良好的棉田植株根際土壤中分離而來。

1.1.2 試劑

DNA Marker、Goldview I型核酸染料、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒及2×EsTaqMasterMix分別購自北京康為世紀生物科技有限公司、北京索萊寶科技有限公司和上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物

細菌16S rDNA擴增參考采用通用引物27F/1492R；芽孢桿菌rpoB基因特異性引物按照引物設計原則以Genbank中6株標準芽孢桿菌rpoB基因組序列為參考，試驗引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)。表1

表1 鑒定所需PCR引物序列

Table 1 PCR primers used for species identification

目標基因Target gene引物Primer核苷酸序列Nucleotide sequence 5’-3’16S rDNA27FAGAGTTTGATCCTGGCTC1492RCGGCTACCTTGTTACGACTTrpoBHr-fAGGTCAACTAGTTCAGTATGGACHr-rAAGAACCATAACCGGCAACTT

1.1.4 供試棉花

供試棉花：品種圍為新陸中54號。

對照藥劑：80%多菌靈WP(石家莊亞潤科技發展有限公司生產)，按照使用說明配制1 500倍液。

1.1.5 發酵液與發酵液的制備

生防菌發酵液為LB培養基不加瓊脂，將HFW217在發酵液中28℃，12/24 h光照培養24 h后，按1∶20的比例再次接種到發酵液中28℃，180 rpm/min，振蕩培養4 d備用。

1.2 方 法

1.2.1 生防菌HFW217的生理生化測定

生防菌HFW217的生理生化鑒定包括培養性狀、生理和生化測定三個方面，利用掃描電鏡對菌株形態和大小進行測定，其它指標參考《常見細菌系統鑒定手冊》[13]中記載的方法進行。

1.2.2 生防菌HFW217的16S rDNA分子序列測定

1.2.2.1 細菌基因組DNA提取

改良酚氯仿法；從新鮮培養物中刮取足量的菌體于離心管中，加入200 μL 10×TE和20 μL 50 mg/mL溶菌酶溶解，于37 ℃ 180 rpm條件下恒溫搖床震蕩4 h，至酶解徹底。取出后加入20% SDS 50 μL、蛋白酶K(20 mg/mL)5 μL ，60℃條件下水浴2 h，取出后加入1/10體積CTAB/NaCl，并補加5 mol/LNaCl至終濃度0.5 mol/L，混勻后等體積加入氯仿/異戊醇，12 000 r/min離心10 min，取上清置新離心管加1/10體積的3 mol/LNaCl，再加2倍體積的預冷無水乙醇，于-20℃條件下沉淀DNA過夜，取出后12 000 r/min離心10 min，倒去上清，加入70%冰乙醇洗滌2～3次，干燥后加入100 μL 10×TE重新溶解，置于-20 ℃條件下保存。

Ezup柱式法：方法采用改進的SDS-CTAB法。基因組DNA提取參照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作進行，對提取后的基因組DNA用10×TE溶解后，置于-20℃條件下保存。

1.2.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR)

向無菌PCR管內加入25 μL PCR mastermix，4 μL模板，上下游引物各2 μL，并補足ddH2O，制成50 μL PCR體系。PCR反應設陽性對照PCR管1支，空白(陰性)對照1支，待測樣品2支。

PCR擴增條件為：94℃預變性4 min，94℃變性1 min，52℃引物復性90 s，72℃延伸3 min，共進行35個重復，最后72℃延伸10 min[19]。

1.2.2.3 PCR結果的電泳檢測

用1×TAE配置1%瓊脂糖凝膠，溶后待冷卻至不燙手時(約55℃)加入goldview II 染色劑至終濃度為0.5‰，制膠。將凝固完全的膠放入電泳槽，使電泳液高出凝膠約1 mm，進行點樣，點樣完成后于110 V恒壓電泳35 min，取出后置于凝膠成像系統下進行拍照。

1.2.2.4 16S rDNA序列分析及系統發育樹繪制

對PCR產物進行測序，利用BLAST軟件對測序獲得的16S rDNA序列與Genbank數據庫進行比對分析，并在Clustal X(1.8)程序中對相近序列進行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析，用Neighbor-Joining法構建基于16S rDNA的系統發育樹。

1.2.3 生防菌HFW217溫室和田間防效測定

溫室試驗在塔里木大學植保站溫室中進行。選取長勢一致的棉花苗在兩葉一心期接種棉花枯萎病菌，待棉花葉片出現零星病斑時開始噴藥。每隔7 d噴藥一次，共噴藥3次，在第一次噴藥之前和最后一次噴藥后7 d統計病情指數。調查分級標準和防治效果，計算方法參照參考文獻[14]。計算結果用DPS數據處理系統分析5%水平的差異顯著性。田間防效試驗設在塔里木大學植物保護試驗田，處理及數據分析參照溫室試驗。

2 結果與分析

2.1 生防菌HFW217的生理生化測定

2.1.1 菌落形態

HFW217菌株在LB上的菌落形態顯示，菌落隆起有皺褶，淡黃色不透明，粘稠有臭味，無水溶性色素，單菌落形態為近圓形。圖1

圖1 HFW217在LB培養基上的培養形狀

Fig.1 Culture shape of HFW217 on LB medium

圖2 HFW217掃描電鏡圖片

Fig.2 Scanning electron microscopy picture of HFW217

2.1.2 菌體形態與大小

HFW217菌株的菌體形態為短桿狀，大小為(0.5～0.8)×(1.1～3.0)μm。圖2

2.1.3 生理測定

HFW217芽孢呈橢圓形，著生于菌體中部，無鞭毛，革蘭氏染色為陽性菌，可耐受45℃的高溫和15℃的低溫；HFW217在無鹽狀態以及11%鹽濃度下均可生長。HFW217在葡萄糖為碳源的培養基中生長優于以甘露醇為碳源的培養基，在硝酸鉀、硝酸銨，草酸銨為氮源的培養基中均生長不良。表2，表3

表2 HFW217生長溫度

Table 2 Growth temperature of HFW217

溫度Temperature/℃HFW21710﹣15﹢25﹢28﹢35﹢40﹢45﹢50﹣55﹣

注：，陽性反應；-，陰性反應

Note:, positive reaction; -, negative reaction

表3 HFW217的耐鹽性試驗

Table 3 Salt tolerance test of HFW217

NaCl的質量分數Mass fraction of NaCl/(%)HFW2170﹢2﹢5﹢7﹢10﹢11﹢12﹣

注：，陽性反應；-，陰性反應

Note:, positive reaction; -, negative reaction

2.1.4 生化鑒定

研究表明，硝酸鹽還原和過氧化氫酶均為陽性，葡萄糖發酵產酸，水解淀粉、明膠，pH 6.8和pH 5.7下均能生長，不產生吲哚，不水解卵磷脂，不形成二羥基丙酮，孢囊膨大，不能水解酪素，不能利用檸檬酸鹽，能發酵L-阿拉伯糖、D-木糖和甘露醇。

結合《常見細菌系統鑒定手冊》，HFW217與解淀粉芽胞桿菌的描述最相近，鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表4

表4 HFW217生化測定

Table 4 Biochemical test results of HFW217

特征 CharacteristicHFW217特征 CharacteristicHFW217細胞直徑>1.0 μmCell diameter>1.0 μm﹣卵黃卵磷脂Yolk lecithin﹣芽孢形狀Spore shape橢圓明膠液化Gelatin liquefaction﹢孢囊膨大Cyst enlargement﹢利用檸檬酸鹽Utilization of citrate﹣過氧化氫酶實驗Catalase experiment﹢L-阿拉伯糖L-pectinose﹢硝酸鹽還原Nitrate reduction﹢甘露醇Mannitol﹢產生吲哚Indole production﹣發酵D-葡萄糖Fermentation of D-glucose﹢脲酶實驗Urease experiment﹢D-木糖D- xylose﹢水解淀粉Hydrolyzes starch﹢生長PH: 6.8 營養肉湯Growing PH: 6.8 nutritional broth﹢酪素水解Casein hydrolysis﹣生長PH: 5.7 營養肉湯Growing PH: 5.7 nutritional broth﹢

注：，陽性反應；﹣，陰性反應

Note: +, positive reaction; -, negative reaction

2.2 HFW217的基因檢測

2.2.1 HFW217的PCR擴增產物電泳檢測

經電泳檢測16S rDNA大小在1 400～1 600 bp(圖3a)，對上海生工測序結果讀圖和拼接后得16S rDNA序列1 455 bp。采用芽孢桿菌特異性rpoB引物擴增在500～600 bp范圍內有擴增產物(圖3b)，對上海生工測序結果讀圖后得rpoB基因序列557 bp。圖3

2.2.2 16S rDNA序列比對與同源性

HFW217菌株16S rDNA基因序列與47株芽孢桿菌科細菌相似性在91%以上。相似性在92.36%～99.72%的有43株，均為芽孢桿菌屬；2株為枝芽孢桿菌屬，相似性為93%；1株為耐鹽短桿菌，相似性為98.90%；株為乳桿菌屬，相似性為91.67%。序列相似性大于95%和97%的菌株除一株耐鹽短桿菌外，其余均為芽孢桿菌屬細菌。16S rDNA基因序列相似性位列前三的分別為甲基營養型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌。列出序列相似性>95%的結果。表5

圖3 PCR擴增產物的電泳結果(1%瓊脂糖凝膠)

Fig.3 The result of electrophoresis for PCR amplification products with 1% agarose gel

表5 HFW217菌株16S rDNA序列比對

Table 5 The alignment for 16S rDNA of strain HFW217

序號Rank名稱Name菌株編號Strain登錄號Accession相似性Similarity(%)1Bacillus methylotrophicusCBMB205(T)EU194 89799.722Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarumFZB42(T)CP000 56099.453Bacillus siamensisKCTC13 613(T)AJVF01 000 04399.384Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciensDSM7(T)FN597 64499.115Bacillus subtilis subsp. subtilisNCIB3 610(T)ABQL01 000 00199.116Brevibacterium halotoleransDSM8 802(T)AM747 81298.907Bacillus atrophaeusJCM9 070(T)AB021 18198.908Bacillus vallismortisDV1-F-3(T)JH600 27398.839Bacillus mojavensisRO-H-1(T)JH600 28098.8310Bacillus subtilis subsp. spizizeniiNRRLB-23 049(T)CP002 90598.7611Bacillus licheniformisATCC14 580(T)AE017 33397.5912Bacillus aerius24K(T)AJ831 84397.3813Bacillus stratosphericus41KF2a(T)AJ831 84196.8414Bacillus aerophilus28K(T)AJ831 84496.8415Bacillus pumilusATCC7061(T)ABRX01 000 00796.5616Bacillus vietnamensis15-1(T)AB099 70895.6417Bacillus aquimarisTF-12(T)AF483 62595.3218Bacillus acidicola105-2(T)AF547 20995.1119Bacillus marisflaviTF-11(T)AF483 62495.0520Bacillus shackletoniiLMG18 435(T)AJ250 31895.04

2.2.3 rpoB基因的序列比對與同源性

HFW217菌株rpoB基因序列比對相似性大于91%的有101株，其中97%的菌株提示為芽孢桿菌屬。基因相似性大于97%的菌株除2例提示為枝芽孢桿菌屬，相似性在99.4%～99.6%以外，其它顯示均為芽孢桿菌屬菌株，其中解淀粉芽孢桿菌及其亞種、枯草芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌出現較多。序列相似性100%的9株菌株中8株為解淀粉芽孢桿菌及其亞種，1株為芽孢桿菌屬，其分類學尚不明確。

2.2.4 16S rDNA基因系統發育樹

研究表明，從遺傳進化關系上，HFW217與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌等共屬一個進化分支。經1 000次重復檢驗中，一致的分支數值均不足70[11]，不能從16S rDNA角度判斷HFW217具體為解淀粉芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌等其中哪一種。對HFW217菌株16S進化樹中出現的菌株分別進行分子鐘檢驗，發現與HFW217菌株16S rDNA基因處于同一進化分支上的各菌株經χ2檢驗P>0.05，均能接受具有相同分子進化速率的假說。圖4

2.2.5 rpoB基因系統發育樹

從NCBI數據庫下載的同源性高于97%的菌株rpoB基因，構建Neighbour-Joining Tree。HFW217與解淀粉芽孢桿菌處于同一進化分支，并且與兩株解淀粉芽孢桿菌普魯蘭酶亞種Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum具有相同的進化距離。與HFW217同樣具有相同進化距離的一株枯草芽孢桿菌916菌株，從分子進化角度也靠近解淀粉芽孢桿菌。結合兩個進化樹分析，菌株HFW217可能與當前農業生防已廣泛應用的解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株[11]有更近的物種關系。在對HFW217與其rpoB基因進化樹中出現的菌株進行分子鐘檢驗，其中唯一差異位點數最少的為與HFW217處于同一進化分支的三株菌株，經χ2檢驗可以接受HFW217與解淀粉芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌具有相同分子進化速率的假設。其中經檢驗得HFW217與解淀粉芽孢桿菌UCMB5113和FZB42在卡方檢驗中P=1接受具有相同分子速率的假設。圖5

圖4 HFW217菌株16S rDNA基因系統發育樹(臨位連接法)

Fig.4 Phylogeny tree for 16S rDNA of strain HFW217 (Neighbour-joining)

圖5 HFW217菌株rpoB基因系統發育樹(臨位連接法)

Fig.5 Phylogeny tree for rpoB gene of strain HFW217 (Neighbour-joining)

2.3 生防菌HFW217對棉花枯萎病的溫室和田間防效

研究表明，菌株HFW217對棉花枯萎病的預防效果可達81.80%，治療效果為74.62%，預防效果高于發病后的治療效果；而田間試驗菌株HFW217對棉花枯萎病的預防效果80.97%，治療效果為73.18%，預防效果也高于發病后的治療效果。與對照藥劑多菌靈相比，生防菌HFW217的預防效果和治療效果均較為顯著。表6，表7

表6 生防菌HFW217對棉花枯萎病的溫室防治效果

Table 6 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in greenhouse

處理Treatment預防 Prevention治療 ControlHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized waterHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized water處理前病指Pre-treatment disease index---15.3315.3515.47處理后病指Post-treatment disease finger13.8817.3676.2821.6524.4185.79防治效果Control efficiency81.80a77.24b-74.62c66.75d-

表7 生防菌HFW217對棉花枯萎病的田間防治效果

Table 7 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in field

處理Treatment預防 Prevention治療 ControlHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized waterHFW217多菌靈Carbendazim無菌水Sterilized water處理前病指Pre-treatment disease index---16.3616.8316.71處理后病指Post-treatment disease finger15.6721.7782.3623.3125.8988.34防治效果Control efficiency80.97a73.57b-73.18b70.97c-

3 討 論

結合生理生化和16S rDNA以及rpoB基因序列比對和遺傳進化分析，認為菌株HFW217屬于解淀粉芽孢桿菌，從基因水平分析，HFW217的親緣關系上可能與解淀粉芽孢桿菌普魯蘭酶亞種的親緣關系最近。通過生理試驗測定，發現這株解淀粉芽孢桿菌能夠在鹽濃度為11%和45℃培養條件下生長，比較符合HFW217來源于南疆鹽堿土壤的生活環境，也比較容易在南疆田間環境發揮生防作用。通過溫室和田間試驗分析，HFW217對棉花枯萎病防效顯著。

與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及甲基營養型芽孢桿菌等多個芽孢桿菌相比，菌株HFW217的16S基因序列相似性極高，在分類學上很難將其區分。與耐鹽短桿菌在基因序列上也存在很高的相似性，通過早期對菌株HFW217的形態學和生理生化的研究發現HFW217是一株產芽孢革蘭陽性細菌，可以與不產芽孢的耐鹽短桿菌區分開。HFW217菌株的rpoB基因較16S rDNA序列相似性更高，最高達到100%，從rpoB基因進化距離估算和進化樹分析，菌株HFW217 與解淀粉芽孢桿菌具有穩定一致的分子進化關系[15]。雖然從NCBI數據庫中下載的BucillussubtilisStr.916在NCBI數據庫分類為枯草芽孢桿菌，但綜合rpoB基因進化樹結果可以看出，枯草芽孢桿菌916菌株分子進化關系也更靠近解淀粉芽孢桿菌，這與歐洲數據庫(ezGenome)提示的分類學關系一致。從rpoB基因進化情況還可以判斷，HFW217與甲基營養型芽孢桿菌相比具有更長的進化距離，從進化角度可以排除HFW217為甲基營養型芽孢桿菌。其他在兩種基因比較和進化分析選擇中并未同時出現的菌種和菌株無法更詳細判斷種間進化關系遠近。

對于芽孢桿菌近緣種間鑒定僅從序列的相似性較難判斷親緣關系，必要時需要結合形態學的觀察，如該例鑒定中對耐鹽短桿菌的排除。其次，16S rDNA基因序列在對芽孢桿菌屬內近緣種間關系的判斷并不如rpoB基因對這種近緣種關系判斷具有更大的貢獻，這與基因分子中種的基因獨特性相關。從進化的估計來看，16S rDNA序列過于保守，序列系統發育樹分支冗余，在親緣較近的種，如解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等表現出的進化距離相同，給種的鑒定增加了較多不確定性。相比16S rDNA基因，rpoB基因雖然具有更大基因分子獨特性，但難以尋找如16S rDNA擴增使用的通用引物，需要針對特定屬或若干種進行引物設計。

由于芽孢桿菌產芽孢的特性，這成為研究之前其他形態學和生理生化研究工作區分芽孢桿菌與非芽孢桿菌的主要依據，而生理生化和形態學研究并不能直接具體確定芽孢桿菌屬具體的種，這主要與芽孢桿菌近緣種具有極相似的生理生化特性相關。研究方法中16S rDNA基因的研究為選擇特異性的引物提供了主要參考依據，而單獨對于芽孢桿菌16S rDNA在芽孢桿菌近緣種中的鑒定貢獻并不明顯。研究原計劃從16S rDNA、rpoB、gyrB三個基因著手開展鑒定工作并比較三個不同基因區段對于細菌鑒定的貢獻，但gyrB基因的擴增一直未能設計篩選出合適的引物，從國內外研究的比較中可以得出gyrB基因對于細菌鑒定的敏感性可能不如rpoB基因，但從芽孢桿菌已知菌株gyrB基因區域中單核苷酸多態性較豐富的表現，gyrB基因可能在芽孢桿菌近緣種的鑒定中具有較大貢獻。gyrB基因和rpoB基因利用其單核苷酸多態性的特性在鑒定工作中的貢獻在國內外其他臨床微生物的研究中貢獻也有體現，如諾卡氏菌種[16]。進化分析對基因序列的比對分析使用的MEGA6.06較MEGA5.0除了繼承之前的算法以外，在進化距離估計和相關性的分析提供更多的便利以及引入科學統計學算法直觀呈現統計學相關性分析結果比較同一進化分支和不同進化分支的關系[17]。

解淀粉芽孢桿菌對多種植物病害都有一定的抑制作用，是一類重要具有生物防治作用的芽孢桿菌，例如對香蕉枯萎病[18]、油菜核盤菌[19]、尖孢鐮刀菌[6]、草莓蛇病菌[20]、大花惠蘭根腐病[21]、辣椒疫霉[22]、水稻細菌性條斑病[23]、馬鈴薯枯萎病菌和炭疽病菌[24]、大豆根腐病[25]、炭疽病[26]等都有不同程度的抑制作用。目前，解淀粉芽孢桿菌作為農藥中的殺菌劑已在生產中應用，陜西加倫多生產的10億活芽孢/克可濕性粉劑被登記用于防治水稻稻瘟病[27-28]。研究中，解淀粉芽孢桿菌對棉花枯萎病的溫室和田間防效顯著，與以往研究不同的是，解淀粉芽孢桿菌HFW217從南疆半沙漠化、半鹽堿化生態環境中分離而來，能夠耐受新疆干旱、鹽堿和寒冷等自然條件，具有抗逆特性。

4 結 論

與多個芽孢桿菌相比，HFW217菌株的16S rDNA基因序列與43株芽孢桿菌科細菌相似性92.36%～99.72%；而16S rDNA進化關系上，菌株HFW217與枯草芽孢桿菌、西姆芽孢桿菌等在分類學上也很難區分。HFW217菌株的rpoB基因較16S rDNA序列相似性更高，序列相似性100%的9株菌株中8株為解淀粉芽孢桿菌及其亞種，1株為芽孢桿菌屬。采用16S rDNA、rpoB基因序列和生理生化結合的方法對HFW217進行鑒定，其結果是該生防菌是解淀粉芽孢桿菌B.amloliquefaciens。菌株HFW217在溫室和田間對棉花枯萎病的預防效果為81.80%和80.97%，防治效果分別為77.62%和73.18%，均明顯高于對照藥劑，具有潛在的應用價值。