不同品種香蕉種植地土壤微生物多樣性及其對土壤理化性質的響應

鄧大豪 鄧濤 周游 汪軍 楊臘英 郭立佳 黃俊生

摘 ?要??本研究以廣西不同品種香蕉種植地土壤微生物為研究對象，利用擴增子測序技術、Spearman相關性分析、RDA分析等方法對土壤微生物豐度與多樣性進行測定分析，闡述了香蕉及種植地土壤理化性質對土壤微生物豐度與多樣性的影響。結果表明：香蕉土壤細菌樣品OTU總量與真菌樣品OTU總量比率大約是2∶1;香蕉枯萎病病原菌所在屬Fusarium占屬水平豐度5.132%～55.132%;Spearman相關性分析顯示Fusarium與土壤理化性質無顯著相關;真菌的豐度與多樣性比細菌更易受到土壤的理化性質與營養元素的影響，單一土壤理化性質無法顯著影響土壤微生物的群落結構和物種組成;土壤真菌在一定程度上體現香蕉品種的抗病性程度。

關鍵詞 ?土壤微生物;擴增子測序;香蕉;抗病性中圖分類號??Q143??????文獻標識碼??A

Soil Microbial Diversity and Its Response to Soil Physical andChemical Properties under Different Banana Varieties

DENG Dahao^1，2， DENG Tao^1，2， ZHOU You¹， WANG Jun¹， YANG Laying¹， GUO Lijia¹，HUANG Junsheng^1，2*

1. Environment and Plant Protection?Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?In this study， soil microorganisms in different banana growing areas in Guangxi were taken as the research object. Amplicon sequencing technology， Spearman correlation analysis， RDA analysis and other methods were used to determine and analyze the abundance and diversity of soil microorganisms. The effects of physicochemical properties of banana and soil on soil microbial abundance and diversity were discussed. The results showed that the ratio of total OTU of banana soil bacterial samples to that of fungal samples was approximately 2∶1.Fusarium， the genus of the pathogen of banana wilt， accounted for 5.132% to 55.132% of the genus abundance. Spearman correlation analysis showed that there was no significant correlation betweenFusariumand soil physicochemical properties.Fusariumhad no significant correlation with soil physical and chemical properties. The abundance and diversity of fungi were more easily affected by soil physical and chemical properties and nutrients than bacteria. The single soil physical and chemical properties could not significantly affect the community structure and species composition of soil microorganisms. To a certain extent， soil fungi reflect the degree of disease resistance of banana varieties.

Keywords ?soil microbes; amplicon sequencing; banana; disease resistance

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.026

土壤微生物是陸地生態系統的重要組成部分，對生態系統中物質轉化和養分循環有重大影響，是土壤和植物中介者，影響著生態系統的結構與功能^[1--4]。土壤微生物群落對環境條件的改變很敏感，環境條件包括植被組成、溫度、降水等，環境條件的變化會導致微生物群落的結構變化，微生物群落的結構變化會導致土壤肥力及作物產率的變化^[5--7]。因此，研究香蕉種植地土壤理化性質及香蕉抗病性對土壤微生物多樣性的影響，對于防控香蕉枯萎病具有重要意義。

香蕉（Musa spp.）為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬植物，起源于東南亞，在世界130多個國家廣泛種植。香蕉既是重要經濟作物和糧食作物，也是僅次于水稻、小麥、玉米的第4大糧食作物^[8]。中國是世界香蕉原產地之一，有3000多年種植歷史。目前，根據我國主要食用蕉假莖的顏色、葉柄溝槽、果實特征及經濟性狀，簡單分為香牙蕉、大蕉、粉蕉、龍牙蕉和貢蕉5大類^[9]。香蕉枯萎病（亦稱巴拿馬病）是由尖孢鐮刀菌古巴專化型[Fusariumoxysporum f. sp.cubense （Foc）]侵染所致，對生產影響最大的Foc是侵染幾乎所有栽培蕉的熱帶型4號生理小種（tropical race 4，TR4）^[10]。一個多世紀以來，香蕉枯萎病一直是香蕉商業生產和自給農業種植的嚴重制約因素^[11-13]，不利于香蕉產業的健康可持續發展。香蕉枯萎病是一種典型的維管束和土傳真菌病害，也是最具毀滅性的植物病害之一^[14]。這種疾病侵襲了我國所有香蕉種植園的主要生產區域，病原體難以控制且在土壤中持久存在，迄今尚無有效的控制措施^[15-16]。目前的主流研究方向是生物防治，即通過篩選能夠抑制病原菌生長的有益菌，再將有益菌接種到土壤里面，以期實現生物防控土傳病害的目的。

對香蕉及其土壤微生物的研究主要集中在復合菌劑、甘蔗渣、土壤熏蒸劑、堆肥、輪作等對香蕉、土壤酶活、微生物菌群結構等的影響^[17-21]。張志紅等^[22]研究了不同肥料對土壤微生物功能多樣性影響以及與防病關系，發現肥料防病效果與土壤微生物功能多樣性變化趨勢相反;李進等^[23]研究了堿性肥料對土壤微生物多樣性及香蕉枯萎病發生的影響，發現堿性肥料能有效防控香蕉枯萎病的發生;鄧曉等^[24]比較研究了香蕉枯萎病患病與健康蕉園土壤微生物群落功能多樣性，發現患病樣地土壤微生物群落功能多樣性明顯低于健康樣地。同時，研究發現健康植株和不同感病級別植株根際土壤中的微生物數量均明顯高于非根際，就細菌和放線菌來看，感病植株的根際效應最明顯^[25]。目前尚未有對香蕉種植地土壤微生物相對豐度和群落組成，優勢細菌的功能、環境參數與細菌群落的相關性以及香蕉抗病性與土壤微生物關系的系統性研究。鑒于此，本文以廣西香蕉種植地為研究區，利用擴增子測序技術對香蕉種植地土壤微生物群落功能多樣性進行研究，以期揭示香蕉種植地土壤微生物群落豐度和組成、優勢菌屬的功能、土壤理化性質與微生物關系、香蕉抗病性與土壤微生物的關系，為后續防控香蕉枯萎病提供依據。

1??材料與方法

1.1樣品采集

2018年7月，每個樣地采用多點采樣混合法，用采樣器采集0～10 cm土壤樣品并立即用聚乙烯無菌袋密封置于冰盒中帶回實驗室，充分混勻后分為2份，1份置于-40 ℃低溫冰箱冷凍保存，在1周內用于土壤微生物DNA的提取和分析，另1份自然風干后研磨，用于土壤各理化指標的測定。樣品WM11、WM12、WM21、WM22、WM31采自廣西武鳴縣培桂村，JS91、JS92、JS93采自廣西隆安金穗。其中WM11、WM12、JS91、JS92、JS93為種植1年的抗病品種桂蕉九號;WM21、WM22為種植5年的較易感病品種桂蕉六號;WM31為種植5年的易感病品種桂蕉一號。

1.2方法

1.2.1 ?土壤理化性質的測定??取風干土壤，過2 mm篩，用于土壤理化性質的測定。直接用pH計測定土壤 pH，水土比2.5∶1;燒法測定土壤含水率（moisture content，MC）、有機質含量（organic substances content，OSC）;浸提-蒸餾法（2 mol/L KCl）測定土壤銨態氮（ammonium nitrogen，NH₄⁺-N）含量;鉬銻抗比色法測定速效磷（available phosphorous，AP）含量;火焰光度計法（NH₄OAc 浸提）測定速效鉀（available potassium，AK）含量^[26]。使用北京順科達TR-8D土壤自動記錄儀測定電導率（electrical conductance，EC）、鹽度（salinity，SAL）、總溶解固體（total dissolved solids，TDS）。

1.2.2??土壤微生物DNA提取 ??香蕉種植地土樣中微生物的DNA按照天根土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336-02）說明書的方法進行提取。

1.2.3 ?16S rRNA和ITS rRNA基因的引物擴增及高通量測序??擴增16S rDNA的V3+V4區域，細菌的PCR引物是341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG -3'，806R：5'- GGAC T ACNNG GGTATC TAAT-3'。擴增ITS rDNA的ITS1-5F區域，真菌PCR引物是ITS5-1737F：5'-GGAAGTAAAAGTC GTA ACAAGG-3'，ITS2- 20 43 R： 5'-GCTGCGTTC T TC ATC GATGC-3'。提取的土壤微生物DNA由北京諾禾致源科技股份有限公司進行擴增子測序。測序基于IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序（Single-End）的方法，構建小片段文庫進行單端測序。

1.3數據處理

IonS5TMXL下機數據為fastq格式，使用Cutadapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后^[27--29]，進行97%的一致性的OTUs（operational taxonomic units）聚類和物種分類分析^[30]。根據OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況^[31]-[32]。對OTUs進行豐度等分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等^[33]。同時，結合環境因素進行RDA分析（redundancy analysis，RDA）和多樣性指數與環境因子的相關性分析，得到顯著影響組間群落變化的環境影響因子^[34--36]。運用SPSS軟件對香蕉抗病性與土壤微生物進行相關性分析。

2??結果與分析

2.1香蕉種植地微生物群落功能多樣性指數分析

細菌和真菌測序深度指數均在0.99以上。細菌香農-威納指數（Shannon-Wiener）在8.084到9.498之間，辛普森多樣性指數（Simpson）在0.981以上，樣品OTU總量（observed species）在1670到2302之間。真菌Shannon-Wiener指數在4.872～6.913，Simpson多樣性指數在0.813以上，樣品OTU總量837到1164之間。細菌樣品OTU總量與真菌樣品OTU總量比率大約是2∶1。

2.2香蕉種植地的優勢菌

根據物種注釋結果，選取每個樣品最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖（圖1）。Proteobacteria（17.947%～45.014%）或Actinobacteria（16.359%～41.576%）在香蕉種植地豐度最高。門水平真菌Ascomycota占30%～?75%，為最優勢門。真菌Fusarium，Saitozy ma，Trametes為優勢屬。香蕉枯萎病病原菌所在屬Fusarium占5.132%～55.132%。

2.3環境參數與菌群的相關性

Spearman相關性分析是用Spearman秩相關來研究環境因子與物種之間的相互變化關系，得到兩兩之間的相關性和顯著性P值。細菌菌屬與環境參數（表1）顯著相關的有（圖2A）：Chujaibacter與電導率、鹽度、總溶解固體顯著正相關，Acid o ther mus與有機質含量顯著負相關，Pseu d o monas與速效磷顯著正相關。Jatrophiha bitans與pH極顯著負相關。RDA分析反映菌群與環境因子之間的關系，細菌RDA的累計貢獻率RDA1 26.12%，RDA2 15.94%（圖3A）。影響按大小排序：鹽度>電導率>總溶解固體>速效磷>pH>有機質含量>銨態氮。VPA分析（variance partitioning canonical correspondence analysis）研究各環境因子對微生物群落分布的解釋率。細菌中，pH、Con.、Sal.、Tot.、Org.、N、P、K分別代表pH、電導率、鹽度、總溶解固體、有機質、銨態氮、速效磷、速效鉀。Env1為N、P、K一組，Env2為pH、Con.、Sal.、Tot.、Org.一組。Env1單獨的解釋量為18.02%，Env2單獨的解釋量為30.86%，兩組環境變量的共同解釋量為51.12%，結果表明Env2對樣本分布的影響要大于Env1。

真菌Spearman相關性分析以下顯著相關：Saitozyma與pH顯著負相關，Trametes與速效磷顯著正相關，Chaetomium與電導率、鹽度、總溶解固體顯著正相關，BisiFusarium與pH顯著負相關（圖2B）。Fusarium與環境參數無顯著相關。真菌RDA分析的累計貢獻率RDA1 18.89%，RDA2 16.68%（圖3B）。真菌中，Env1單獨的解釋量為20.35%，Env2單獨的解釋量為41.84%，兩組環境變量的共同解釋量為37.81%，結果表明Env2對樣本分布的影響要大于Env1。

3??討論

土壤微生物的生物指標影響著土壤的理化性質與營養元素，包括土壤微生物的豐度、多樣性等方面^[23-24]。土壤微生物多樣性和其種群結構調控著土壤各種非生物指標，包括土壤pH、電導率、鹽度、總溶解固體、有機質含量等。土壤pH與抑病性呈負相關，微生物群落失衡可以體現在土壤物理指標^[37]。本研究中香蕉種植地的土壤pH為5.26～7.35。采集土壤2個區域為強酸性，1個區域為酸性，5個區域為中性，存在土壤酸化的危險，降低抵御香蕉枯萎病的能力。平衡的土壤微生物群落是土壤健康的重要指標。一般來說，高質量的土壤具有較高的細菌多樣性，但真菌多樣性低于低質量的土壤^[38]。WM21細菌種群水平失衡，屬水平Chujaibacter（12.540%）與Acidother mus（6.847%）與其他顯著不同，樣品OTU總量最低，為1670，同時WM21真菌樣品OTU總量較高，為1041，土壤有從細菌型向真菌型轉化的趨勢。WM21土壤酸化、鹽漬化，導致土壤微生物群落結構的改變，具有香蕉枯萎病的潛在發生危險。

WM11為抗病品種桂蕉九號;WM21為較易感病品種桂蕉六號;WM31為易感病品種桂蕉一號。真菌樣品OTU總量是WM31>WM21>WM11，說明在樣品中越易感病，真菌樣品豐度、多樣性指數越大。WM11真菌門水平中相對豐度超過10%的有Ascomycota和Basidiomycota，Ascomycota?（46.213%）>Basidiomycota（32.807%）;WM21真菌門水平中相對豐度超過10%的有Ascomycota和Basidiomycota，Ascomycota?（32.700%）>Basidiomy cota?（12.925%）;WM31真菌門水平中相對豐度超過10%的只有Ascomycota，Ascomycota（46.184%）>?Basidiomycota（8.991%）。在樣品中越易感病，真菌門水平中相對豐度中Ascomycota和Basidiom ycota相對豐度相差越大。WM11、WM21和WM31真菌屬水平中相對豐度Others各占45.557%、69.865%和75.502%。在樣品中越易感病，真菌屬水平中相對豐度Others占比例越高。綜上所述，感病品種和抗病品種的抗病性與土壤真菌關系較大，土壤真菌豐度、多樣性指數在一定程度上體現香蕉品種的抗病性程度。

以往土壤微生物多樣性的研究主要用稀釋平板法、Biolog Eco 微孔板方法、變性梯度凝膠電泳等，揭示土壤理化性質與土壤微生物群落的關系^{[17-18， 20， 25]}。第二代高通量測序技術提供了強有力的工具來研究微生物的群落結構和物種組成，更能克服傳統方法的局限，靈敏地檢測出環境微生物群落結構和物種組成與外界環境的細微關聯^[21]。鄧超超等^[39]研究耕作措施對隴中旱農區土壤細菌群落的影響時發現，秸稈覆蓋處理不僅提高了土壤細菌群落的豐度和多樣性，且特有細菌類群也相對較高，其中尤以免耕秸稈覆蓋最為突出;尚天翠等^[40]在研究新疆野生櫻桃李林不同生態條件下土壤細菌數量變化及其影響因素時發現，土壤有機質含量和全氮含量與細菌數量正相關;劉艷霞等^[41]在研究貴州省典型植煙生態區域根際土壤微生物群落多樣性時發現，不同生態區域的微生物結構與土壤碳、氮、有機質含量及pH與土壤微生物區系都沒有對應關系，土壤微生物結構是受多種因素綜合影響和決定的。本研究中Fusarium與環境參數無顯著相關，但香蕉枯萎病是典型的土傳病害，帶菌土壤是主要侵染來源之一，可能需要進一步研究到單個物種，才能通過擴增子測序方式研究熱帶型4號生理小種與環境關系。RDA分析主成分RDA1、RDA2，貢獻率分別為18.89%和16.68%，表明并非單一土壤理化性質能夠顯著地影響土壤微生物的群落結構和物種組成，而是綜合因素共同作用的結果。在VPA分析中，真菌與細菌結果相同，Env2對樣本分布的影響要大于Env1，即pH、電導率、鹽度、總溶解固體、有機質含量一組影響力要大于銨態氮、速效磷、速效鉀一組，真菌更易受到Env2的影響，與曹志平等^[42]研究結果相一致，即以細菌分解途徑為主導的土壤，能夠快速降解有機質含量，提高氮礦化率，養分供應迅速;以真菌途徑為主的土壤有利于存貯有機質含量和固持氮，氮和能量轉化較緩慢。比較而言，前人多研究香蕉枯萎病的防治方法，不曾研究香蕉土壤理化性質、抗病性對土壤微生物多樣性影響及普遍變化規律，本文豐富了香蕉枯萎病的研究結果。在實際應用中，可以通過改變土壤微生物菌群結構來防治香蕉枯萎病，這對香蕉生產具有重要意義。

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