除草劑Atrazine對四膜蟲BF5株種群增長的影響

張博霏

摘?要：研究了嗜熱四膜蟲BF5株?（Tetrahymena thermophila?BF5）種群在莠去津（Atrazine）脅迫下的整個變化過程，通過對不同濃度莠去津處理下的種群密度變化，種群自然增長差異，以及種群密度變化的時間差異，對莠去津的相對安全濃度尤其是其對水生原生動物四膜蟲的耐受濃度作初步研究。結果表明，在實驗條件下50ppb濃度莠去津已使四膜蟲種群無法進入對數生長，100ppb濃度使種群受到嚴重擾動，150ppb以上濃度使種群在48小時內消亡。24小時半致死濃度為64.75ppb，96小時半致死濃度為39.10ppb。

關鍵詞：嗜熱四膜蟲BF5株;莠去津;種群密度

隨著生活水平的提高，人們對糧食作物和經濟作物需求日益增長，在土地自然產力有限，新的高產品種投入產業化生產尚需時日的現狀下，增加包括除草劑在內的各種農業化學品的用量和使用頻度，成了目前的主要增產方式。然而，在農業產品的增產背后，是相當沉重的生態代價，甚至直接或者間接地威脅到了人類自身的安全和健康。本實驗所選取的研究藥品——莠去津?（Atrazine）?就是一種長期以來被認為是低毒，甚至是對人類完全安全的除草劑產品，被長期并且廣泛地施用。其結果就是這種藥物在環境中的普遍存在，在土壤、水體和不少農產品中均存在一定劑量的檢出。

1 莠去津（Atrazine）及其相關研究情況

1.1 莠去津介紹

莠去津是繼西瑪津之后1958年由瑞士嘉基公司開發的三嗪類除草劑，是旱地除草劑主要品種之一，在國內外應用比較廣泛。由于莠去津的優良性能及價格優勢，目前世界上很多國家普遍應用，是國內大量生產的除草劑品種之一。隨著我國除草劑需求量和使用量的增長，國內莠去津原藥注冊生產企業達到20家以上，年產能超過6萬噸，已經成為北方地區使用量最大的除草劑品種之一。

莠去津其他名稱有阿特拉津、草脫凈、Aatrex，Aktikon，Coyote和Gesaprim等，化學名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪。其化學結構式為：

莠去津純品為白色粉末，由三聚氰酞氯與等當量的乙胺和異丙胺在脫酸劑存在下作用得到。熔點175.80C，相對密度123，微溶于水，稍溶于有機溶劑。在中性、微酸性或微堿性介質中穩定，遇強堿和強酸易分解，土壤中DT?50?100天，水體中代謝時間與許多因素相關。另據USEPA的資料，其在水體中的DT?50?160天左右，溫度較低時所需時間更久。

1.2 有關莠去津毒性情況的研究

2003年4月加州大學伯克立分校的Tyrone Hayes等人的研究結果使得人們對莠去津等除草劑的使用安全性再次產生質疑，相對3ppb的莠去津飲用水殘留標準，實驗中所使用的濃度要相對安全得多。在對非洲爪蛙（?Xenopus laevis?）的蝌蚪進行了試驗時，他們把處于發育階段的蝌蚪放到含有不同濃度的莠去津的水溶液中。當莠去津的濃度達到0.1ppb時，雄性蝌蚪除了長出睪丸外，還長出了卵巢。而當濃度達到1ppb時，雄蛙用來引吭求偶的喉管便無法正常發育，這注定使它們在成年后無法正常求偶。此外，研究人員把雄蛙置于含25ppb的莠去津水溶液中，它們的睪酮水平迅速下降。據此研究人員分析認為，莠去津可能促使芳香族酶產物大量產生，結果把雄激素催化成了雌激素，從而使得雄蛙變成了雌蛙或不雄不雌的“陰陽蛙”。也就是說，對于實驗中所涉及的兩棲類而言，莠去津可以作為一種環境激素來看待。

1.3 各國對莠去津使用及其殘留量的控制標準

鑒于莠去津的潛在的或已部分顯露的生態損害，在學界對莠去津的安全性問題存在一定程度的分歧的情況下，美國環保局（USEPA） 于2003年10月31日公布了莠去津臨時登記決議。加拿大病蟲害防治管理局（PMRA）依據美國環保局的報告建議削減莠去津的用量并于2004年1月1日起生效。歐盟國家則在同一時期或更早時間限制或完全禁止了莠去津的使用。

相對其他國家的控制力度，我國對于莠去津的控制顯得較為寬松，根據中國國家標準化管理委員會（SAC） 2005年10月3日發布的G/SPS/N/CHN/88中規定莠去津在蘋果和梨中的最大殘留限量為200ppb，另在G/SPS/N/CHN/87中規定莠去津在農田灌溉水的限量標準為150ppb。但在最新的生活飲用水國家標準GB 5749-2005中規定莠去津殘留應少于2ppb，甚至少于美國的3ppb標準，可見我國已開始關注其潛在的危害性。

2 四膜蟲介紹（材料與方法）

隸屬于原生動物門、寡膜綱、膜口目、四膜科、四膜蟲屬。已知有10余種。體長40～60微米，成倒卵形或梨形。口位于腹面前方正中，體表被以縱纖毛帶，口后纖毛帶一般為2條。胞肛和2個伸縮泡孔均位于細胞后端。無性生殖為橫分裂。有性生殖為接合生殖。合子核分裂分化產生新的大小核，兩細胞分開、分裂。

世界性分布，主要產自淡水，也有的生活于咸水或溫泉中。四膜蟲能在無菌的液體培養基中生長繁殖，長期以來用它為材料做了大量營養生長和藥物學方面的研究，是真核細胞基因工程研究的理想材料。

2.1 材料

2.1.1 嗜熱四膜蟲BF5株（?Tetrahymena.thermophila?BF5）

嗜熱四膜蟲BF5株（?T.thermophila?BF5）為實驗室培養純化后的四膜蟲品系，廣泛用于各種實驗。實驗用四膜蟲經實驗選用培養液1周以上培養，并保證其在實驗所選用培養環境下可正常繁殖后予以使用。

2.1.2 莠去津藥液

本次實驗所選用的原液為50%莠去津溶液，使用雙蒸水稀釋至10mg/L與1mg/L兩種濃度的實驗用液密封保存備用。

2.1.3 四膜蟲培養液

實驗中可以供選擇的培養液和培養基種類很多。主要有如下幾種：Singer氏培養液、Elliott氏培養液、（月示）胨培養液、沈錫祺等所用的有機培養液以及實驗用四膜蟲的原培養液配方，另有固體培養基配方3個。

2.2 方法

2.2.1 相關儀器設備

使用的主要儀器設備如下：

OLYMPUS BH-2型?臺式光學顯微鏡

珠江 LRH-250-G型光照培養箱?廣東省醫療器械廠

FA1004型??電子天平?上海天平儀器廠

YXQ602型?電熱式蒸汽消毒器?山東新華醫療器械廠

5-50μL、20-200μL、1-5mL移液槍?Therme Electron

200mL三角瓶、10mL及5mL試管、10mL帶蓋培養管、20及100mL量筒、試管架、各容量燒杯、超凈工作臺、2mL*24目細胞培養板、100目藻類計數板等

2.2.2 培養液的選擇和培養中理化指標的控制

本次實驗綜合考慮了手頭可使用的藥品、預實驗中四膜蟲的生活情況以及培養液的保存情況，最終選用如下培養液作為菌種保存和實驗所用培養液。

培養遵循少量——多管獨立培養，統一時間轉接，正式實驗前，菌種在選定培養液中經至少一個完整的種群增長過程。培養溫度為26℃±1℃，無光照，PH 7.0左右，每12小時或更短間隔搖勻一次以保證培養液中溶解氧。考慮到四膜蟲對氧的需求及較長的培養時間，擴增初期采用10mL試管中加2-3mL培養液的少量多管并列培養的方式，這在一定程度上也可避免在初期種群密度較低時意外混入的雜菌對培養進度的影響。

3 結果與分析

3.1 關于種群的觀察數據

于27 ℃恒溫培養6小時后開始觀察計數，經過約186小時 16次觀察計數之后確認實驗組種群完全消失，期間數據見附表一。各梯度種群密度變化情況如下圖。由于150ppb以上濃度數據量較少，故不單獨繪圖。

3.2 關于個體差異的觀察數據

空白組和50ppb組在前期均存在核交換和結合生殖，空白組更是保持到了穩定期之后仍有核交換，其他各組在實驗過程中未發現有性生殖現象。平均個體大小在各組中的差別并不明顯，但在同一管內的個體中存在差別，分析為分裂生殖所致。同時，在較高濃度（≥150ppb）的組中以及在趨于衰退的管中，非規則形態的個體以及行動能力低下的個體明顯增多。

3.3 來自藥物因素的影響分析

其他的實驗證明莠去津對呼吸活動主要是線粒體活性有抑制作用，考慮其為藥品抑制種群的主要因素。

3.4 來自非藥物因素的影響分析

其他因素如溫度PH等，特別是pH值和培養液內溶解氧對四膜蟲種群的影響也是比較明顯的。實驗初期發現，在pH值在5以下的培養液中種群難以生長，甚至在短時間內消亡，當pH在6.5-7.5的情況下，四膜蟲種群可正常生長。實驗周期較長，又無法向管中補充氧氣，即使使用容積為10mL的培養管進行5mL以下的培養并間隔一定時間晃動，當種群密度上升到一點數量后，可用肉眼觀察到培養液上層接近液面處的密度要大于液體下層，可見其存在一定程度的缺氧。

4 結論

以上的分析和部分推斷，對于實驗所用的四膜蟲菌株，50ppb或以下濃度才是安全的，100ppb是實驗所用的四膜蟲菌株的耐受極限，超過該值的莠去津濃度會導致種群在48小時左右崩潰。即使莠去津對包括人類在內的溫血動物毒性不是相當大，但是作為一種半衰期如此長的化學物質，很難不考慮其慢性毒性和其他不被確定或未知的危害性。相對最新的飲用水標準的2ppb濃度標準，水果（如蘋果、梨）中的200ppb，農業灌溉用水的150ppb，乃至糧食作物（如玉米）中的50ppb標準都不算低，從保證食品安全的角度，以及突破農產品貿易中的技術壁壘考慮，都有必要作出更嚴格的限定。

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