刺玫果藥材中黃酮類成分測定

王光函， 姜 鴻， 張振秋， 尤獻民， 鄒桂欣*

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院遼寧沈陽110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學遼寧大連116600)

中藥質(zhì)量控制和評價是中藥現(xiàn)代化的瓶頸，中藥多成分的復雜性決定了單一成分或指標評價難以表達中藥的質(zhì)量，并由此提出多成分質(zhì)量控制的模式［1-2］，本試驗采用Agilent 1100高效液相色譜儀對刺玫果藥材中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素［3］4種成分同時進行測定，更有效的控制刺玫果藥材質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent1100，DAD檢測器，美國)XS105電子天平(梅特勒-托利多中國地區(qū))。

1.2 試藥 蘆丁對照品(批號:10080-200306)、金絲桃苷對照品(批號:1521-200202)、槲皮素對照品(批號:10081-200406)、山柰素對照品(批號:110861-200304)均購自中國藥品生物制品檢定所。刺玫果的干果購于亳州藥材市場。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，其余所用試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB C18(4.6 mm×150 mm);流動相:甲醇(D)，乙腈-四氫呋喃(1 ∶19)(C)，0.5%醋酸水(A)［4］，梯度洗脫程序見表1。體積流量:1.0 mL/min;檢測波長:360 nm;柱溫:30℃。結(jié)果見圖1和圖2。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 對照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備 取刺玫果藥材(粉碎后)10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流至提取液無色(約2 h)，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無色(約4 h)，提取液蒸干，殘渣加稀乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液［5］。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素分別為 38.06 μg、162.65 μg、53.93 μg、4.994 μg的混合對照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件分別進樣，測定峰面積，以進樣量與峰面積進行線性回歸，回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)分別為:

蘆丁:Y=0.003X+0.000 5 r=0.999 8 線性范圍:0.038 1 ～0.456 7 μg

金絲桃苷:Y=0.011X+0.000 2 r=0.999 9 線性范圍:0.162 6 ～1.951 8 μg

槲皮素:Y=0.005X+0.000 3 r=0.999 9 線性范圍:0.053 7 ～0.647 4 μg

山柰素:Y=0.000 8X+0.000 2 r=0.999 8 線性范圍:0.005 ～0.059 9 μg

2.5 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液于配置后0、4、8、12 h時，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，測定各峰面積，計算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素質(zhì)量分數(shù)，其RSD分別為1.56%、0.82%、1.23%和1.02%，表明穩(wěn)定性良好。

2.6 對照品精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，平行5次，測定峰面積。蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的RSD分別為0.18%、0.22%、0.19%和0.18%，表明精密度良好。

2.7重復性試驗 取樣品10 g，5份，精密稱定，按供試液制備方法處理，測定峰面積，計算樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的質(zhì)量分數(shù)，其RSD分別為2.09%、2.00%、1.87%和1.81%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取樣品5 g，5份，精密稱定，分別精密加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品適量，按供試液制備方法處理，分別計算回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果

2.9 樣品中黃酮的測定 精密吸取供試品溶液10 μL，每個樣品取3份，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，以3次測定結(jié)果的平均值作為測定值，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 測定波長的選擇 曾采用Agilent紫外分光光度計對蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品溶液分別進行掃描，4者在254 nm和360 nm下均有較大吸收，但是用DAD檢測器對供試品測定時發(fā)現(xiàn)，供試品溶液在254 nm下基線不穩(wěn)，且干擾較多，故選擇360nm作為測定波長［6］。

3.2 之前筆者曾采用等度洗脫系統(tǒng)對刺玫果中蘆丁和金絲桃苷進行定量測定，本試驗在此基礎(chǔ)上采用梯度洗脫系統(tǒng)對黃酮類成分進行測定，為更好的評價刺玫果藥材的質(zhì)量。

3.3 文獻報道，刺玫果總黃酮能降低腦血管阻力，增加冠脈血流量，提高小鼠耐缺氧能力［7-8］，且我國東北野生資源豐富，本試驗選擇黃酮類成分進行測定，為刺玫果資源的客觀評價提供依據(jù)［9-10］。

3.4 中藥化學成分多樣且復雜，在指標選擇方面，應開展質(zhì)量標示性指標與內(nèi)在質(zhì)量性指標相結(jié)合的方法研究，即應選擇多指標質(zhì)量控制的方法。實現(xiàn)對中藥多指標成分的控制，也有助于說明藥物的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，使中藥新藥研究逐漸明確其所含化學成分并控制其量和穩(wěn)定性。這與現(xiàn)階段新法規(guī)［11-13］對中藥新藥研究的要求是一致的，在中藥質(zhì)量標準中尤其是新藥質(zhì)量標準中，應努力向建立多指標定量測定的方向發(fā)展，盡可能實現(xiàn)對多種不同工藝、多種指標成分的定量測定控制，多方面控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高現(xiàn)代中藥制劑的質(zhì)量控制水平。

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［4］中國藥典［S］.一部.2010:30.

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［7］張 遠.刺玫果提取物對心血管系統(tǒng)的作用［J］.中草藥，1985，16(1):20-24.

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［10］陳英智，李立新.刺玫果［J］.特種經(jīng)濟動植物，2001，(9):26.

［11］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于實施《藥品注冊管理辦法》有關(guān)事宜的通知.國食藥監(jiān)注［2007］596號［S］.2007-09-26.

［12］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)中藥注冊管理補充規(guī)定的通知.國食藥監(jiān)注［2008］3號［S］.2008-01-07.

［13］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求的通知.國食藥監(jiān)注［2007］743號［S］.2007-12-06.