礦泉水中微生物檢測能力驗證結果與分析

何善英

【摘 ?要】為了提高實驗室對礦泉水中微生物的檢測能力，參加了由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心（ACAS）組織的礦泉水中微生物檢測能力驗證（ACAS-PT550/551/552/553）。依據能力驗證作業指導書和GB8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》對樣品進行大腸菌群、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌及產氣莢膜梭菌測定，采用全自動微生物生化鑒定系統鑒定可疑菌落。結果顯示，所有項目的∣統計量（Z）∣均<2.0，結果均為滿意。實驗室能很好地應用GB8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》開展微生物檢測。

【關鍵詞】能力驗證;微生物;飲用天然礦泉水

中圖分類號：TQ460.6 文獻標志碼：B

1材料與方法

1.1樣品

本次礦泉水微生物能力驗證包含4個項目，每個項目2個樣品。真空西林瓶內裝白色凍干物，復原后即為人工污染的礦泉水樣品。由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，項目名稱、項目代碼及對應樣品標識分別為大腸菌群ACAS-PT550：18-R848、18-J093;銅綠假單胞菌ACAS-PT551：18-N468、18-U473;糞鏈球菌ACAS-PT552：18-J636、18-K197;產氣莢膜梭菌ACAS-PT553：18-H425、18-S133。

1.2儀器與試劑

HFsafe-1500LC型生物安全柜GHP-9160型隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）;GR110DR型立式高壓蒸汽滅菌器（美國ZEALWAY）;VITEK2Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）;DM4B型leica數字顯微鏡（上海徠卡顯微系統貿易有限公司廣州分公司）;微生物過濾系統（美國密理博）;ZF-1B型紫外分析儀（上海汗諾儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（瑞士Salvislab）;智能氣體工作站Anoxomat MARKⅡ（荷蘭MART公司）。乳糖膽鹽發酵培養基（批號：160829）;亮綠乳糖膽鹽培養液（BGLB）（批號：170830）;KF鏈球菌瓊脂培養基（批號：171008）;腦心浸萃液體培養基（批號：180412）;腦心浸萃瓊脂培養基（180412）;假單胞菌瓊脂基礎培養基/CN瓊脂（批號：180512）;金氏B培養基（批號：170921）;亞硫酸鹽-多黏菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）（批號：160512）;液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）（批號：180105）;動力-硝酸鹽培養基（180504）;含鐵牛奶培養基（批號：180612）;卵黃瓊脂培養基（批號：180409）;乙酰胺肉湯（批號：180413）;鈉氏試劑（批號：180510）;3%過氧化氫酶試劑（批號：180710）;膽汁肉湯（批號：180727）;美國密理博，直徑47mm，孔徑0.45μm濾膜（批號：F4BA80390）;杭州吉沃，直徑47mm，孔徑0.45μm（批號：20180702）、0.22μm濾膜（批號：20180608）;VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡（GN）（批號：2410252413）;VITEK2革蘭氏陽性細菌鑒定卡（GP）（批號：2420689403）;VITEK2革蘭氏厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡（ANC）（批號：244069920）。VITEK2細菌鑒定卡由法國生物梅里埃提供，其余試劑均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.3方法

按照ACAS《礦泉水中微生物檢測能力驗證作業指導書》進行樣品處理，按GB8538—2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》[3]55～58條款進行樣品檢測，采用VITEK2Compact全自動微生物生化鑒定系統進行菌株鑒定，綜合以上試驗結果出具報告。同時以糞腸球菌ATCC19433、大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、熒光假單胞菌ATCC49642、產氣莢膜梭菌CICC22949作為對照菌進行陽性和陰性對照試驗。試驗全過程按照GB19489—2008《實驗室生物安全通則要求》[4]在生物安全柜中無菌操作進行。

（1）樣品水化待樣品恢復至室溫后，開啟樣品（西林瓶包裝），立即加入20mL無菌水進行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復用余下的無菌水清洗西林瓶內壁（共520mL無菌水），回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，等同于520mL的待測礦泉水樣品。

（2）大腸菌群多管發酵法檢測，推測性檢驗：以無菌操作取10mL水樣，加入10mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液中;取1mL水樣，加入10mL單料乳糖膽鹽發酵培養液中;取1mL水樣，加入9mL無菌生理鹽水中，混勻，吸取此稀釋水樣1mL，加入10mL單料乳糖膽鹽發酵培養液中;繼續稀釋水樣并接種到單料乳糖膽鹽發酵培養液中，共接種5個稀釋梯度，每個梯度接種5份，36℃培養25h，觀察每管是否產氣。若有氣體產生，該管則為推測性檢驗陽性，需進行確證性試驗;若不產氣則為陰性。

（3）糞鏈球菌檢測，推測性檢驗：用0.45μm的濾膜分別過濾10mL、25mL、50mL、100mL、250mL待測樣液原液，每個接種量都先加到一定量的無菌水中，使其最終體積為250mL，然后過濾，以無菌操作方法將濾膜貼于KF鏈球菌瓊脂平板表面，倒置，36℃培養48h;觀察平板菌落形態，挑取5個以上可疑菌落進行革蘭氏染色并鏡檢。根據菌落特征符合情況計數所取水樣中的典型菌落數。用無菌生理鹽水清洗杯壁并過濾，同時用自制加標水樣做對照。確證性試驗：從平板上挑取5個以上可疑菌落接種到腦心浸萃瓊脂培養基斜面，36℃培養24～48h，挑取所生長菌落進行氧化氫酶試驗、45℃生長試驗及膽汁肉湯試驗。同時采用VITEK2Compact全自動微生物生化鑒定系統鑒定可疑菌落。綜合以上結果計算每250mL水樣中的糞鏈球菌數。

2結果

2.1大腸菌群

實驗室采用多管發酵法檢測礦泉水中的大腸菌群，每個樣品接種10mL、1mL、0.1mL、0.01mL、0.001mL5個稀釋梯度，結果見表1。報送結果時參照GB4789.39—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗糞大腸菌群計數》附錄B確定最適稀釋度，樣品18-R848大腸菌群檢測結果為2400MPN/100mL，統計量（Z）=-1.1;樣品18-J093大腸菌群檢測結果為1300MPN/100mL，Z=1.3。兩樣品Z<2.0，結果滿意。

2.2糞鏈球菌

參照能力驗證作業指導書稀釋倍數不超過100倍原則，選取過濾10mL、25mL、50mL、100mL及250mL5個水樣量過濾，結果見表2。該項目樣品目標菌純度較高，KF鏈球菌平板上呈現典型的紅色圓形菌落，革蘭染色為陽性球菌，過氧化氫酶陽性，45℃生長試驗陽性，膽汁肉湯試驗生長陽性，VITEK2革蘭氏陽性鑒定卡鑒定為98%糞鏈球菌。菌落形態及生化反應結果同陽性對照菌株一致。選取菌落數在20～100CFU的濾膜計數，最終結果報告為樣品18-J636：2100CFU/250mL，Z=0.8，Z<2.0;樣品18-K197：90CFU/250mL，Z=0.5，Z<2.0，結果滿意。

參考文獻：

[1]鄧梅清，張菊梅，郭偉鵬，潘寶怡，吳清平.礦泉水中銅綠假單胞菌污染狀況調查研究[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19（11）：2672-2673.

（作者單位：紹興市中測檢測技術股份有限公司）