多粘類芽孢桿菌ARTP誘變及高產(chǎn)菌株的選育

閔勇 王穎 劉曉艷 陳偉 劉芳 楊自文 王開(kāi)梅 周榮華?

摘? ?要：多粘類芽孢桿菌NBF188對(duì)番茄青枯病菌的病原菌茄科勞爾氏菌具有顯著抑菌效果。采用常溫常壓等離子體誘變（ARTP）的方法處理該菌株，篩選得到高產(chǎn)菌株NBF188-R。NBF188-R抑菌效果較出發(fā)菌株有顯著的提高，HPLC-MS檢測(cè)顯示其多粘菌素的產(chǎn)量提高了106.2%。

關(guān)鍵詞：多粘類芽孢桿菌;番茄青枯病菌;常溫常壓等離子體誘變;多粘菌素

文章編號(hào)： 1005-2690（2019）13-0040-02? ? ? ?中圖分類號(hào)： TQ925.4? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生多肽類抗生素，統(tǒng)稱為多粘菌素，于1947年被發(fā)現(xiàn)[1-2]。多粘菌素以非核糖體肽形式合成，能與存在于細(xì)胞膜上的脂多糖作用，破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)，因此對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用[3]，且多粘類芽孢桿菌對(duì)植物具有非致病性，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定，是一種理想的生防菌，同時(shí)具有促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)的作用，目前在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上均有廣泛的應(yīng)用[4-5]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，多粘類芽孢桿菌主要用于茄果類蔬菜青枯病的防治。茄果類青枯病是一種毀滅性的土傳性病害，俗稱植物“癌癥”，是由茄科勞爾氏菌引發(fā)的一種生理性病害。

菌種選育是一種將菌株經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)誘變處理后，篩選得到產(chǎn)量提高的正突變菌株的技術(shù)。其中紫外線照射處理和化學(xué)物質(zhì)處理是常用的誘變手段。常壓室溫等離子體（ARTP）作為一種方便快捷的誘變手段，在菌種選育中被廣泛地應(yīng)用，已有許多試驗(yàn)證明該方法能夠高效地篩選得到正突變菌株[6-7]，不過(guò)由于一些突變體不穩(wěn)定，后期選擇合適的篩選方法和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證很關(guān)鍵。

試驗(yàn)選用一株能有效抑制茄科勞爾氏菌生長(zhǎng)的多粘類芽孢桿菌NBF188，采用常壓室溫等離子體誘變（ARTP）的方法進(jìn)行誘變育種，同時(shí)通過(guò)高通量篩選獲得高產(chǎn)菌株，為其在田間應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

1.1.1? ?番茄青枯病原菌菌株

試驗(yàn)所涉及的番茄青枯病病原菌分離自發(fā)病的番茄植株。發(fā)病的番茄植株取自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所蔬菜實(shí)驗(yàn)基地。

1.1.2? ?生防菌來(lái)源

多粘類芽孢桿菌NBF188，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保藏。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?平板抑菌測(cè)定篩選生防菌

將番茄青枯病病原菌及多粘類芽孢桿菌NBF188分別接種于SPA和LB液體培養(yǎng)基，置于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)好的菌液調(diào)整OD600至1.0后備用。吸取0.1mL番茄青枯病病原菌作為指示菌，加入200mL融化好的NA培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。將圓形濾紙片平鋪于培養(yǎng)基表面，吸取5μL的NBF188菌液滴在濾紙片上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待能觀察出明顯的抑菌圈時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均值。

1.2.2? ?生防菌的ARTP等離子體誘變及篩選

參照ARTP標(biāo)準(zhǔn)誘變流程處理篩選出來(lái)的生防菌。將菌株搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，此時(shí)OD600值為0.5，取10μL菌液均勻涂抹于金屬載片，將載片移至ARTP誘變育種儀操作室，照射間距約為2mm。設(shè)置儀器誘變功率為100W，氣流量為10SLM。設(shè)置不同的處理時(shí)間分別為20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，制作致死率曲線確定最佳的誘變條件。致死率=（未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-經(jīng)誘變處理菌落數(shù)）/未經(jīng)誘變菌落數(shù)×100%。選擇最優(yōu)輻照時(shí)間，將誘變菌液梯度稀釋后涂布于LB平板，確定最佳誘變和生長(zhǎng)條件。

挑取至少500個(gè)生長(zhǎng)出來(lái)的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，搖床上振蕩培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)出來(lái)的菌液進(jìn)行平板抑菌效果測(cè)定，根據(jù)抑菌圈大小初步判斷高產(chǎn)菌株。將初篩出的菌株接入LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)48h，并采用HPLC-MS液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法準(zhǔn)確的測(cè)定菌液中多粘菌素的產(chǎn)量，從而篩選出5株高產(chǎn)量的誘變菌株。最后對(duì)這些5株誘變菌株分別傳代3次驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?生防菌NBF188的ARTP等離子體誘變

根據(jù)致死率公式，以誘變時(shí)間為橫坐標(biāo)，制作致死率曲線。從圖1中可以看出，等離子體照射處理生防菌NBF188的時(shí)間與其致死率存在明顯相關(guān)性。照射時(shí)間50s時(shí)致死率為91.9%，照射超過(guò)60s后致死率為99%左右。經(jīng)過(guò)測(cè)定，致死率在90%左右NBF188有較高的正突變率，所以50s為合適的生防菌NBF188菌株照射處理時(shí)間。稀釋倍數(shù)為10-4時(shí)菌落數(shù)量最好統(tǒng)計(jì)，總共挑取不少于500個(gè)單菌落進(jìn)行平板抑菌篩選。

2.2? ?ARTP 誘變后高產(chǎn)菌株的篩選

經(jīng)過(guò)3次傳代試驗(yàn)篩選得到的5株抑菌效果最好、且遺傳穩(wěn)定性較好的誘變菌株，重復(fù)測(cè)定抑菌效果。原始菌株作為對(duì)照（CK），對(duì)茄科勞爾氏菌的抑菌效果及HPLC-MC檢測(cè)的多粘菌素特征峰面積結(jié)果如表1。其中3號(hào)較原始菌株的峰面積比為206.2%，抑菌效果及多粘菌素產(chǎn)量均為最好。將其命名為NBF188-R。

3? ?小結(jié)與討論

多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生強(qiáng)抗逆性的內(nèi)生芽孢，抑菌譜廣，對(duì)真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)等引起的植物病害具有防治效果，還能促進(jìn)植物根際定植，對(duì)植物具有促生作用，可增強(qiáng)土壤的通透性，是極具開(kāi)發(fā)潛力的生防菌[8-14]。本試驗(yàn)通過(guò)等離子體誘變篩選到一株高產(chǎn)菌株NBF188-R，將多粘菌素的表達(dá)產(chǎn)量提高了1倍，在后續(xù)試驗(yàn)中可以增加田間試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株NBF188-R防治番茄青枯病的效果。

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（收稿日期：2019-09-15）