蝦干中AFB₁毒素LC-MS/MS檢測方法的建立

王小博 鄭琳 鄭培君

摘 要：通過對前處理方法及色譜、質譜條件的優化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測方法。選用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）為流動相，ESI+掃描模式，乙腈/水（84/16）為提取溶液，提取時間60 min，提取溫度25 ℃，正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測方法快速、準確、靈敏度高。

關鍵詞：AFB1;毒素;蝦干;LC-MS/MS

Abstract：The LC-MS method for the determination of AFB1 in dried shrimp was established by optimizing the pretreatment method and the conditions of chromatography and mass spectrometry. Methanol-water （5 mmol·L-1 ammonium acetate containing 0.1% formic acid） was selected as mobile phase， ESI+ scanning mode， acetonitrile/water （84/16） as extraction solution， extraction time was 60 min， extraction temperature was 25 ℃， n-hexane degreasing and purification. Under this condition， the determination method of AFB1 toxin in dried shrimp is rapid， accurate and sensitive.

Key words：AFB1; Mycotoxin; Dried shrimp; LC-MS/MS

中圖分類號：O657.63

黃曲霉毒素是黃曲霉菌、寄生曲霉菌等產毒菌株產生的次生代謝物。在天然食物中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最易產生、存在最多、毒性最強，具有高致癌性[1]，已被國際癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物[2]。AFB1在自然環境中廣泛存在，其造成的農作物、動物飼料污染和病害時有發生[3]。魚、蝦等水產品攝食被AFB1污染的飼料后，可在體內蓄積，同時水產品在加工制作、儲存過程中不易被消減，誤食被AFB1污染的水產制品會對人類的健康構成巨大威脅。因此，為了保障水產品及消費者安全，應建立快速高效的水產制品中AFB1的檢測方法，從而加強對水產制品的監測。然而，現有的針對水產制品中AFB1毒素的檢測方法還較為缺乏。LC-MS/MS檢測法靈敏性極高、檢測限極低，準確性好，非常適合AFB1的痕量分析，近年來受到了大家的廣泛歡迎[4]。本研究以蝦干為研究對象，通過對色譜條件、質譜條件、毒素提取方法的優化，建立水產制品中AFB1毒素LC-MS/MS檢測方法，從而為水產品中AFB1的檢測提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蝦干購自佛山市市場;AFB1標準品（≥98%），Enzo，USA;甲醇（色譜純，≥99.9%）、乙腈（色譜純，≥99.9%）、乙酸銨、甲酸及乙酸乙酯，天津光復試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

TSQ Quantum Access液相色譜-質譜聯用儀，美國Thermo Scientific公司;渦旋震蕩儀，美國Scientific Industries;離心機，艾本德;氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司;電子天平，上海英恒。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

從濃度為10 μg·mL-1的AFB1母液中取1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，獲得濃度為1 μg·mL-1的AFB1標準儲備液。吸取適量AFB1標準儲備液，用純甲醇配成500 ng·mL-1的毒素標準液，然后根據需要用30%的甲醇溶液配制所需濃度的標準曲線工作液。

1.3.2 色譜條件的建立

色譜柱：Hypersil Gold（100 mm × 2.1 mm，5 μL）;

流動相：甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。進樣體積：10.0 μL;進樣速率：10.0 μL·s-1;采用梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。進樣速率：250.0 μL·min-1。流動相：A甲醇，B 5 mmol·L-1的乙酸銨溶液+0.1%的甲酸溶液。

1.3.3 質譜條件的建立

對目標化合物的質譜條件進行優化，最終選取二級質譜中響應較高的子離子進行SRM的質譜條件優化。

1.3.4 樣品處理

蝦干剪碎后取2.00 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL的乙腈/水（84/16）勻漿，渦旋振蕩10 min

（2 000 r·min-1），超聲萃取10 min，離心5 min

（7 500 r·min-1）后準確移取上清液，重復3次，合并上清液[4];60 ℃下N2吹干，用1 mL30%的甲醇溶液（含5 mmol·L-1 CH3COONH4溶液∶0.1%甲酸=3∶7;V∶V）溶解，加入5 mL正己烷7 000 r·min-1離心

5 min進行脫脂，用一次性注射器取下層液過0.22 μm濾膜于進樣小瓶中。

1.3.5 方法學驗證

（1）線性。空白樣品中加入AFB1的標準溶液，AFB1的濃度范圍為0.5～100 ng·g-1。

（2）準確度和精密度。準確度用AFB1的提取

回收率表示，精密度用AFB1回收率的相對標準偏差的百分數表示（SD）。空白樣品中分別加入50、100、

200 ng·mL-1 AFB1標準溶液，按照1.3.4的方法處理后，上機檢測，重復5次。

（3）LOD與LOQ。最低檢出限（LOD）由3倍信噪比（S/N=3/1）得出，最低定量限（LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10/1）。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

實驗對比了Hypersil Gold-C18柱和Agilent TC-C18柱對AFB1的分離效果，結果發現Hypersil Gold-C18柱對AFB1的分離效果好于Agilent TC-C18柱，因此選擇Hypersil Gold-C18色譜柱。影響LC-MS/MS檢測方法靈敏度的因素除了目標物自身的性質外，還有流動相的組成。本研究比較了甲醇-水、乙腈-水的分離效果和離子化效率，結果發現甲醇與乙腈都能實現目標化合物的分離。在流動相中加入適量的乙酸銨和甲酸能夠提高目標物的離子化效率，同時可以有效改善峰形[5]。在流動相中加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨、0.1%乙酸的5 mmol· L-1乙酸銨，結果發現加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1的乙酸銨，可以明顯增加AFB1的響應值。因此，最終確定流動相為甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）。

2.2 質譜條件的選擇

在正離子（ESI+）模式下對AFB1進行全掃描分析，結果發現AFB1在ESI+模式下生成[M+H]+離子團，因此本實驗采用ESI+監測模式（表2）。AFB1的MRM圖如圖1。

2.3 提取條件的優化

2.3.1 提取時間的優化

在25 ℃下，加標量為20 μg·kg-1，選用乙腈/水（84/16）做為提取溶劑，改變提取時間（20、40、60、80 min及100 min），檢測計算毒素的回收率。由圖2可知，隨著提取時間的增加，當提取時間為60 min時，AFB1毒素的回收率最高。因此，提取時間選為60 min時。

2.3.2 提取溫度的優化

選用乙腈/水（84/16）為提取溶劑，提取時間選為60 min，加標量為20 μg·kg-1，改變提取溫度（5、15、25、35 ℃及45 ℃），檢測計算毒素的回收率。由圖3可知，當提取溫度為25 ℃時，AFB1的回收率達到最高。因此，提取溫度選取25 ℃。

2.3.3 提取溶劑比例的優化

提取時間為60 min，提取溫度為25 ℃，加標量為20 μg·kg-1，選用乙腈-水為提取溶劑，改變溶劑比例（76/24，80/20，84/16，88/12及92/8），檢測并計算毒素的回收率。結果發現：隨著乙腈比例的增加，AFB1毒素的回收率先上升后下降;當乙腈/水為84/16時，AFB1的回收率明顯提高（圖4）。因此，溶劑比例選為84/16。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性和檢測下限

吸取適量的標準溶液，加入空白樣品中，使空白樣品加標量為0、0.5、1、10、50 ng·g-1及100 ng·g-1，參照1.3.4方法進行前處理后上機測定。以AFB1濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果發現，線性相關系數R2為0.999 86，線性范圍良好，蝦干中AFB1的LOD值為0.1 μg·kg-1，LOQ值為0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加濃度為1、50、100 μg·kg-1的AFB1標準溶液。平行測定5次，計算各毒素的回收率和精密度。結果發現AFB1的回收率在84.36%～103.27%。

AFB1的相對標準偏差在1.46%～8.03%。表明本方法用于蝦干中AFB1的提取具有良好的準確度和精密度，符合實驗需求。

3 結論

通過對前處理方法及色譜、質譜條件的優化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測方法。選用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）為流動相，ESI+掃描模式，乙腈/水（84/16）為提取溶液，提取時間60 min，提取溫度25 ℃，正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測方法快速、準確、靈敏度高。

參考文獻：

[1]伏春燕.玉米中三種真菌毒素檢測方法旳研究[D].泰安：山東農業大學，2014.

[2]莫新少.黃曲霉毒素B1暴露及控制的研究進展[J].護士進修雜志，2009，24（1）：32-34.

[3]Wang X C，Liu X D，Liu J C，et al. Contamination Level of T-2 and HT-2 Toxin in Cereal Crops fromAba Area in Sichuan Province， China[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology， 2012，88（3）：396-400.

[4]王小博，施 琦，王雅玲，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定3種水產品中的T-2毒素與HT-2毒素[J].食品科學，2016，37（24）：164-169.

[5]韓 深，劉 螢，王佩葫，等.超高效液相色譜串聯四極桿質譜法快速測定葡萄酒中8種真菌毒素[J].環境化學，2013，32（7）：1417-1421.