維生素C和黃芪多糖對熱應激蛋雞蛋品質及腸道健康的影響

秦 紅 王 帥 陳昱筱 龐治華 王天元 龐全海

(山西農業大學動物科技學院1，太谷 030801)(山西省柳林縣穆村鎮畜牧獸醫站2，呂梁 033300)>(山西省柳林縣動物疫病預防控制中心3，呂梁 033300)

熱應激可導致畜禽采食量、飲水量減少，生產性能降低，腸道菌群紊亂，消化功能失調等，給蛋雞產業帶來巨大損失[1]，其主要通過氧化應激以及炎癥反應等途徑導致機體損傷[2]。腸道是機體第一道免疫防線的重要組成部分，通過營養調控手段，提高腸道免疫力已成為解決熱應激最有效的辦法。維生素C和黃芪多糖(AstragalusPolysaccharides，APS)均有緩解氧化應激的作用[3, 4]。已有研究表明，黃芪多糖除了具有免疫調節、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、造血、護肝以及防止動脈硬化的作用外[5]，還具有提高蛋雞生產性能[6]、增強疫苗免疫效價[7]、抑制腹瀉致病菌繁殖的作用[8]。維生素C是可提高動物的抗氧化性，降低氧化應激代謝過程中所產生的自由基，提高生產性能及免疫力[9]。目前雖然已有大量黃芪多糖和維生素C單獨在飼料中的應用研究，但主要集中于蛋雞的生產性能、蛋品質、血清抗氧化性等，對腸道免疫研究較少。本實驗以蛋雞為對象，通過在飼料中添加黃芪多糖和維生素C，研究其對蛋雞生產性能、蛋品質、腸道形態結構、腸黏膜抗氧化性及相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

采用單因子實驗設計，144只40周齡海蘭褐蛋雞隨機分為3個處理組，每組4個重復，每個重復12只雞，對照組飼喂基礎飼糧，黃芪多糖組飼喂基礎飼糧+0.5 g/kg黃芪多糖，維生素C組飼喂基礎飼糧+0.2 g/kg維生素C。蛋雞置于(33±2) ℃的熱應激環境中，預試期1周，正試期28 d，基礎飼糧為干粉料，參照NRC(1994)蛋雞營養需要配制基礎飼糧，飼糧組成及營養成分見表1。實驗采用三層階梯籠養，每籠3只，各重復均勻分布于雞舍，自然光與人工補光相結合，每天光照時間16 h。自由采食和飲水，每天喂料、收蛋各2次，按常規程序進行雞只免疫和欄舍消毒。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

注：維生素預混料為每千克飼料提供：維生素A 8 000 IU，維生素D 2 500 IU，維生素E 10 IU，維生素B10.8 mg，維生素B22.5 mg，維生素B61.5 mg，維生素B120.004 mg，煙酸 20 mg，葉酸 0.25 mg，泛酸鈣 18mg，生物素0.1 mg。礦物質預混料為每千克飼料提供：Cu 8 mg，Fe 60 mg，Mn 60 mg，Zn 80 mg，I 0.4 mg，Se 0.3 mg。營養水平為計算值。

1.2 實驗材料

維生素C，添加量為0.2 g/kg。

黃芪多糖，其黃芪多糖成分是總量的70%，添加量為0.5 g/kg。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 蛋雞生產性能

實驗期間每天定時記錄各重復產蛋總數、總蛋重和破蛋數，并統計采食量，以重復為單位每周統計各組產蛋率、平均日采食量、平均日產蛋量、平均蛋重和料蛋比。

1.3.2 雞蛋品質

實驗期第28天，分別從每組隨機抽取12枚雞蛋(4枚/重復)用于測定蛋品質指標。蛋殼強度測定儀測定蛋殼強度；蛋殼厚度測定儀測定蛋殼厚度；多功能蛋品質分析儀測定蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色。

1.3.3 腸道抗氧化能力

取十二指腸、空腸、回腸中段，測定前制備成10%的組織勻漿并吸取上清保存于-80 ℃，采用抗氧化試劑盒測定上清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性，上清液蛋白質含量采用BCA試劑盒測定。

1.3.4 腸道形態

無菌剪取十二指腸、空腸、回腸段各0.5 cm，生理鹽水沖洗后，4%多聚甲醛進行固定，4 ℃保存24 h，自來水沖洗后經梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精，石蠟包埋后切成5 μm切片，常規HE染色，每個樣品觀察2張非連續的切片，每張切片選取5個典型的視野，用光學顯微鏡進行觀察測量，測定相應的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度與隱窩深度的比值(絨腺比)。

1.3.5 蛋雞腸道及子宮相關基因表達量的測定

采用Trizol法提取腸道及蛋殼腺組織RNA。測定RNA完整性、濃度和純度后，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存備用。以cDNA為模板, 采用熒光定量PCR技術檢測相關基因，在200 μL的PCR薄壁管中建立PCR反應體系。反應體系20 μL，為cDNA 2.5 μL、上下引物各0.6 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL、6.3μL ddH2O。反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。根據目的基因和內參基因β-肌動蛋白(β-actin)閾值循環(CT)，采用2-△△CT法計算樣品中各目的基因mRNA的相對表達量。引物由上海生工合成，序列見表2。

表2 引物序列信息

1.4 數據統計與分析

運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way-ANOVA)，以Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結果

2.1 黃芪多糖和維生素C對蛋雞生產性能的影響

由表3可知，各處理組產蛋率、平均蛋重、日產蛋重、日采食量及料蛋比均差異不顯著(P>0.05)。

表3 黃芪多糖和維生素C對生產性能的影響

注：同行肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，余同。

2.2 黃芪多糖和維生素C對蛋品質及蛋殼腺相關基因的影響

2.2.1 黃芪多糖和維生素C對蛋品質的影響

由表4可知，與對照組相比，維生素C組蛋殼強度極顯著提高(P<0.01)，黃芪多糖組蛋殼強度顯著提高(P<0.05)。

2.2.2 黃芪多糖和維生素C對蛋殼腺相關基因的影響

如圖1所示，與對照組相比，添加維生素C后，蛋殼腺組織中CA(P<0.01)以及OP(P<0.05)mRNA的相對表達量均極顯著或顯著提高。

圖1 維生素C和黃芪多糖對蛋雞蛋殼腺相關基因的影響

2.3 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶活性及相關基因表達的影響

2.3.1 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶活性的影響

由表5可知，與對照組相比，維生素C組十二指腸、空腸、回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，黃芪多糖組空、回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加維生素C極顯著提高十二指腸SOD活性(P<0.01)，添加黃芪多糖可極顯著提高十二指腸SOD活性(P<0.01)、顯著提高空、回腸SOD活性(P<0.05)。維生素C組和黃芪多糖組均極顯著提高十二指腸、空腸、回腸CAT及GSH-PX活性(P<0.01)。

表5 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化性的影響

2.3.2 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶相關基因表達的影響

由圖2可知，與對照組相比，維生素C顯著提高十二指腸CAT、SOD1基因相對表達量(P<0.05)，顯著提高回腸OH-1 mRNA相對表達量(P<0.05)。添加黃芪多糖可提高十二指腸(P<0.05)、空腸(P<0.01)及回腸(P<0.05)CAT基因相對表達量，提高十二指腸(P<0.01)、空腸(P<0.01)及回腸(P<0.05)組織中OH-1 mRNA相對表達量，提高十二指腸、空腸以及回腸中SOD1 mRNA相對表達量(P<0.01)。而維生素C和黃芪多糖均對SOD2 mRNA表達沒有顯著影響。

圖2 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道抗氧化酶相關基因CAT、OH-1、SOD1、SOD2基因表達的影響

2.4 黃芪多糖和維生素C對蛋雞腸道形態的影響

由圖3可知，與對照組相比，添加維生素C和黃芪多糖可極顯著升高十二指腸、回腸的絨毛高度(P<0.01)，顯著升高空腸絨毛高度(P<0.01)。其中黃芪多糖極顯著降低各腸段的隱窩深度(P<0.01)，極顯著增加絨腺比(P<0.01)。維生素C組十二指腸、回腸絨腺比極顯著增加(P<0.01)。

圖3 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道形態的影響

3 討論

熱應激對蛋雞生產性能有較大危害，會導致蛋雞產蛋率、蛋重下降，其導致的采食量減少是影響蛋雞生產性能的主要因素之一[1]，而采食量下降會抑制功能性卵巢活動，導致卵泡生長受阻并抑制排卵物質的分泌[10]。研究表明，黃芪多糖可顯著提高蛋雞生產性能，提高飼料報酬，并減緩由氧化應激所引起的線粒體功能障礙[6, 11]。李樹文等[12]研究表明，維生素C具有提高熱應激蛋雞采食量、產蛋數及產蛋率的作用。在本實驗中，添加黃芪多糖和維生素C后對熱應激蛋雞的生產性能未見明顯影響，因此，通過檢測腸道抗氧化性、腸道形態、蛋品質及影響蛋品質的相關基因進一步說明其影響。

3.1 黃芪多糖和維生素C對蛋品質及蛋殼腺相關基因的影響

蛋品質主要由蛋白高度、蛋形指數、蛋殼強度、蛋殼厚度、哈氏單位和蛋黃顏色等指標來綜合判斷。熱應激可降低蛋殼厚度及蛋殼強度，增加破損蛋率，影響蛋雞養殖效益[13]。而蛋雞飼糧中添加適量黃芪多糖和維生素C均有改善蛋品質的作用[3, 4]。本研究發現，日糧中添加黃芪多糖和維生素C后其蛋殼強度分別顯著、極顯著高于對照組，與前人結果基本一致，說明黃芪多糖和維生素C有改善熱應激蛋雞蛋殼品質的作用。

蛋殼腺是蛋殼形成的重要部位，鈣離子轉運至殼腺腔后沉積形成蛋殼，因此蛋殼腺在鈣離子跨細胞轉運中發揮重要作用[14]。黃芪多糖和維生素C均有改善熱應激蛋雞蛋殼品質的作用，但其作用的具體機制未知。因此，進一步研究2種添加劑對蛋殼腺的影響，觀察其是否通過影響鈣離子的沉積進而蛋殼品質。碳酸酐酶(CA)具有催化H2CO3分解，促進CaCO3生成的作用[15]。Ma等[16]研究表明，熱應激可降低蛋鴨蛋殼腺中CA mRNA的相對表達量。骨橋蛋白(OPN)是一種磷酸化的細胞外基質蛋白，在多種組織(骨、蛋殼腺等)中存在，參與Ca2+轉運，若該蛋白基因表達減少，會給蛋殼鈣化帶來缺陷[15]。飼糧中添加維生素C可提高蛋殼腺CA和OPN的相對表達量，說明維生素C通過提高CA和OPN的相對表達量進而影響蛋殼品質。

3.2 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道抗氧化能力及抗氧化基因的影響

胃腸道是生物體與腔內容物之間的重要連接，亦是熱應激損傷的敏感部位，熱應激可改變機體抗氧化功能，誘發氧化脅迫，致使體內產生大量自由基，發生氧化應激，進而導致腸黏膜缺血缺氧性損傷，引起腸源性感染[17]。GPX、CAT、SOD活性和MDA含量是反映機體抗氧化功能的重要指標。其中，MDA是反映ROS增加的一個重要參數，ROS過量導致脂質過氧化及氧化應激。GPX、CAT、SOD等亦發揮著重要作用，其中SOD將超氧自由基轉化為H2O2和O2，隨后GPX、CAT獨立地將H2O2轉化為H2O和O2[18]。因此，提高蛋雞腸道抗氧化酶活性，降低MDA含量，與蛋雞健康密切相關。

抗氧化酶基因表達量的增加亦是導致酶活增加的重要原因[23]。本實驗從轉錄水平考察了維生素C和黃芪多糖是否對抗氧化酶基因的表達產生影響。結果顯示，飼糧中添加維生素C和黃芪多糖均可不同程度地提高腸道SOD1、CAT、OH-1基因表達水平，說明維生素C和黃芪多糖均具有促進小腸SOD1、CAT、OH-1基因表達的功能，進而提高了蛋雞腸道的抗氧化性。但維生素C和黃芪多糖均對SOD2 mRNA相對表達量沒有明顯的促進作用，這可能是由于維生素C和黃芪多糖主要通過刺激SOD1影響SOD的活性。馬春陽[24]實驗結果表明抗氧化活性的提高與抗氧化基因的表達呈正相關。本實驗中，小腸組織中抗氧化性基因表達量的上調和組織中相應酶活性的增加的結果一致，進一步驗證前人的結論。結合腸道抗氧化性能的數據后發現，黃芪多糖組抗氧化基因的相對表達量均高于各處理組，表明添加黃芪多糖更有力于提高蛋雞的腸道抗氧化能力。

3.3 維生素C和黃芪多糖對蛋雞腸道形態的影響

腸道是機體中重要的器官之一，在消化、吸收以及免疫防御中起著重要的作用。絨毛高度和隱窩深度可作為判斷成熟黏膜上皮細胞數量的指標，小腸絨毛高度與機體吸收能力成正相關，而隱窩深度增加導致消化功能減弱[25]。研究表明，腸道極易受到熱應激的影響而產生大量自由基并通過脂質過氧化作用損害腸道細胞結構導致絨毛高度降低，隱窩深度變深，絨隱比降低[26]。因此，干預脂質過氧化對維持腸道形態具有十分重要的作用，而維生素C和黃芪多糖均具有干預脂質過氧化的作用。李世召[27]研究表明，雞胚給養維生素C提高了42 d肉雞十二指腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度。雷新宇[28]研究表明，日糧添加1%黃芪多糖顯著降低種公雞十二指腸隱窩深度，并提高空腸絨毛高度/隱窩深度比值。本實驗中，添加維生素C和黃芪多糖在一定程度上均提高腸道絨毛高度。相較于對照組，黃芪多糖更有效地降低了各腸段的隱窩深度，說明維生素C和黃芪多糖均具有維持腸道形態的作用，而添加黃芪多糖對腸道形態的作用更明顯。這可能是由于黃芪多糖除抗氧化作用外，還可通過促進緊密連接蛋白的表達調節腸上皮細胞間的通透性，更有益于腸道形態的維持[28]。

4 結論

維生素C和黃芪多糖均可通過提高腸道抗氧化基因的表達改善抗氧化能力，維持腸道的正常形態，且黃芪多糖的作用優于維生素C。維生素C可通過提高蛋殼腺組織中CA及OP mRNA的相對表達量改善蛋殼強度。維生素C和黃芪多糖對于蛋雞的生長性能均未見明顯影響。