2-甲氧雌二醇對鼻咽癌干細胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響

劉潔瓊 曹永清 李科

[摘要] 目的 探討2-甲氧雌二醇（2-ME2）對鼻咽癌干細胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響。 方法 選取鼻咽癌CNE-2細胞構建鼻咽干細胞模型，采用隨機數字表法分為0 μmol/L組、4 μmol/L組和8 μmol/L組。采用CCK-8細胞增殖實驗檢測各組細胞增殖情況，采用Transwell小室遷移實驗檢測各組細胞遷移情況，采用克隆形成實驗檢測細胞放療抵抗性，采用Western blot檢測核因子-κB（NF-κB）p65和低氧誘導因子（HIF-1α）蛋白表達。 結果 4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞OD值明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞OD值明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組穿膜細胞數明顯少于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組穿膜細胞數明顯少于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。 結論 2-ME2能抑制鼻咽癌干細胞增殖及遷移能力，同時降低其放療抵抗性，機制可能與其抑制HIF-1/NF-κB信號通路有關，值得進一步研究。

[關鍵詞] 2-甲氧雌二醇;鼻咽癌;增殖;遷移;放療抵抗性

[中圖分類號] R739.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0110-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2- methoxyestradiol （2-ME2） on proliferation， migration and resistance to radiotherapy in nasopharyngeal carcinoma stem cells. Methods Nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells were selected to construct nasopharyngeal stem cell model， they were randomly divided into 0 μmol/L group， 4 μmol/L group and 8 μmol/L group by using random number table method. The proliferation of cells in each group was detected by CCK-8 cell proliferation test， Transwell cell migration test was used to detect the cell migration in each group， clonogenic assay was used to detect cell radiotherapy resistance， Western blot method was used to detect the expression of nuclear factor-k-gene-binding （NF-κB） p65 and hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） protein. Results OD value of cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）， and that in 8 μmol/L group was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The number of perforating cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly less than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the number of perforating cells in 8 μmol/L group was significantly less than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The colony-forming ability of cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group after 0 and 8 Gy irradiation was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the colony-forming ability of cells in 8 μmol/L group after 0 and 8 Gy irradiation was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The expression of NF-κB p65 and HIF-1α in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the expression of NF-κB p65 and HIF-1α in 8 μmol/L group was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. Conclusion 2-ME2 can inhibit the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma stem cells， and reduce the radiation resistance， the mechanism may be related to the inhibition of HIF-1/NF-κB signal transduction pathway， it is worthy of further study.

[Key words] 2-methoxy estradiol; Nasopharyngeal carcinoma; Proliferation; Migration; Radiotherapy resistance

鼻咽癌是五官科常見的癌癥之一，我國南方是鼻咽癌的高發區，發病因素可能與環境氣候有關[1]。對于鼻咽癌，臨床上目前有多種治療方法，但手術過程繁瑣，患者預后不佳，有研究創新性地應用2-甲氧雌二醇（2-ME2）基因調控的方式，通過抑制鼻咽癌CNE-2細胞等干細胞增殖及遷移能力來治療鼻咽癌[2]，結果表明，其作用機制可能與2-ME2抑制低氧誘導因子-1α/核因子-κB（HIF-1/NF-κB）信號通路有關。還有研究通過CCK-8細胞增殖實驗檢測各組細胞增殖情況，采用Transwell小室遷移實驗檢測各組細胞遷移情況，采用克隆形成實驗檢測細胞放療抵抗性，采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達[3]。本研究主要探討2-ME2對鼻咽癌干細胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取鼻咽癌CNE-2細胞，購于中南大學腫瘤研究所;麥康凱瓊脂培養基（型號：PM0800-250g，品牌：北京酷來搏科技有限公司）;離心機（型號：BenchMate C8，品牌：Oxford Lab Products）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建鼻咽癌CNE-2干細胞模型? 將CNE-2細胞放入瓊脂培養基中，并放入細胞保溫箱中進行多次傳代培養，得到大量CNE-2細胞進行凍存，以備進行實驗。

1.2.2 實驗分組? 采用隨機數字表法，將構建的CNE-2干細胞分為三組：①0 μmol/L組，培養液中僅加入8 μL二甲基亞砜（DMSO）;②4 μmol/L組，培養液中加入4 μL DMSO和4 μL 2-ME2（濃度4 μmol/L）;③8 μmol/L組，培養液中加入8 μL 2-ME2（濃度8 μmol/L）。

1.2.3 CCK-8細胞增殖實驗? 將三組細胞分別進行CCK-8細胞增殖，取凍存的CNE-2干細胞，按照15 000 r/min的離心速度進行離心分離，離心半徑10 cm，每兩毫升Trizol試劑裂解的樣品中加入0.4 mL的氯仿，進行裂解操作，25℃水浴采用CCK-8細胞進行誘導增殖，再次15 000 r/min離心10 min再培養，以檢測各組細胞增殖活力情況。

1.2.4 Transwell小室遷移實驗? 將三組細胞分別進行Transwell遷移侵襲實驗，取凍存的CNE-2干細胞，按照20 000 r/min的離心速度進行離心后應用基質膠鋪板后制備CNE-2干細胞懸液后檢測各組細胞遷移和侵襲情況。

1.2.5 克隆形成實驗? 分別取三組細胞將細胞核取出后，與體細胞細胞質結合，進行克隆培養實驗后，對三組細胞分別進行放療照射，觀察細胞存活性。

1.2.6 Western blot檢測? 將三組細胞分別進行Western blot檢測，將培養好的CNE-2干細胞放在兩塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，將配制好的聚丙烯酰胺分離膠液體并脫氣，然后放入15%的過硫酸銨鈉和四甲基乙二胺，輕輕攪拌混勻。按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，將以上兩種材料進行充分混合后將分離好的CNE-2干細胞與混合液一起水浴40 min后進行充分清洗，再將硝酸纖維素膜與CNE-2干細胞進行混合后顯色以觀察NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達情況。

1.3 統計學方法

統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖活力比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞OD值明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞OD值明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組細胞Transwell小室遷移實驗比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組穿膜細胞數明顯少于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組穿膜細胞數明顯少于4 μmol/L組（P < 0.05）。見表2、圖1。

2.3 各組細胞照射后克隆形成能力比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見表3、圖2。

2.4 各組細胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見表4、圖3。

3 討論

鼻咽癌的病理病因目前認為與三種因素有關，即遺傳因素、病毒因素（主要為EB病毒感染）和環境因素，對于鼻咽癌的治療臨床上方法很多，但治療效果都不確切，本研究主要從基因表達層面抑制鼻咽癌細胞的增殖轉移。

2-ME2基因是一種近年來被發現的抑癌物質，2-ME2在機體內有抑制多種蛋白通路和鼻咽癌發生、發展的作用[4]，2-ME2可視為鼻咽癌的“抑癌基因”。2-ME2通過對CNE-2細胞上皮間充質胚胎轉化后在鼻咽癌的疾病進程中起到抑癌基因的作用，2-ME2能通過抑制鼻咽癌基因表達從而抑制鼻咽癌CNE-2干細胞的增值、轉移和侵襲[5]。本研究證實，2-ME2基因對鼻咽癌細胞CNE-2干細胞特性具有調控作用，并且證明了2-ME2能夠特異性調控鼻咽癌相關基因的表達，從而實現其抑制鼻咽癌干細胞增殖的作用，結果提示，可以將2-ME2作為抑制鼻咽癌治療藥物，療效確切。

本研究應用2-ME2作用于鼻咽癌CNE-2細胞后，檢測細胞的增殖、遷移及侵襲能力。采用CCK-8細胞增殖實驗檢測各組細胞增殖情況，CCK-8是一種檢測鼻咽癌細胞存活和生長的方法，檢測原理是CNE-2細胞RNA中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性CCK-8細胞氧化還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在CNE-2干細胞中，而死細胞無此功能[6]。當細胞增殖時并不影響藍紫色結晶甲瓚存在于CNE-2干細胞中的數量，會隨著細胞增殖而分裂增多，伴隨在細胞質中不斷裂解為更小的粒子，當CNE-2干細胞增殖趨向最大化完成時，DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在700 nm波長處測定其吸光度值，可間接反映CNE-2細胞增殖的數量[7]。在細胞數量處于可控的范圍內時，CCK-8結晶形成的量與細胞數呈正相關關系[8]。CK-8細胞增殖實驗法特點是靈敏度高、經濟，對于測量出細胞增殖的數量數據準確可靠。

采用Transwell檢測各組CNE-2細胞遷移和侵襲，Transwell檢測實驗是指將CNE-2細胞放入培養板中，培養板中存在上下兩個小室，在本研究中上下兩個小室內分別存有CNE-2細胞上下兩層的層培養液并以聚碳酸酯膜相隔[9]。應用此膜可將CNE-2細胞在不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜上進行細胞遷移、侵襲的研究[10-11]。

研究中需利用Western blot檢測各組細胞2-ME2蛋白表達，該方法是采用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，被檢測物是CNE-2細胞轉錄后的2-ME2基因蛋白[12-13]。經過PCR擴增RNA后，將轉錄后的2-ME2基因蛋白轉移到固相載體如瓊脂膠體上，固相載體吸附蛋白質后仍能保持電泳分離的2-ME2表達基因的活性[14]。鼻咽癌CNE-2干細胞誘導HIF-1/NF-κB信號通路由聯級放大反應活化絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，該聯級反應可放大鼻咽癌組織電生物信號，控制細胞相關的生命活動，促進鼻咽癌增殖和遷移。該通路主要由兩種蛋白組成，分別是NF-κB p65和HIF-1α蛋白。有大量研究[15-17]顯示，當細胞過度表達NF-κB p65上游激活因子時，能夠激活鼻咽癌干細胞增殖遷移能力，抵御外界進行放療時對鼻咽癌細胞造成損傷，促進鼻咽癌損傷癌細胞進行修復。HIF-1是鼻咽癌HIF-1/NF-κB信號轉導通路中的重要細胞因子，對細胞增殖、分化和凋亡都起著非常重要的調控作用，它能誘導鼻咽癌干細胞加速分化[18]，對放射治療能做出防御反應[19-20]。

本研究結果顯示，2-ME2濃度越高，CNE-2干細胞增殖能力越低，說明2-ME2對鼻咽癌細胞具有明顯的殺傷抑制作用。2-ME2濃度越高，CNE-2干細胞遷移效率越低，說明2-ME2對鼻咽癌細胞起到抑制作用，并使細胞運動能力下降。2-ME2濃度越高，CNE-2干細胞克隆程度越低，說明2-ME2對鼻咽癌細胞具有明顯殺傷作用，阻止CNE-2干細胞克隆繁殖。2-ME2濃度越高，CNE-2干細胞對NF-κB p65、HIF-1α蛋白表達有明顯抑制作用，說明2-ME2能抑制HIF-1/NF-κB信號通路，增加放療的敏感性。本研究的創新點在于，應用2-ME2有效抑制鼻咽癌細胞信號轉導通路，抑制相關蛋白表達，并增加放療敏感性。

綜上所述，2-ME2能抑制鼻咽癌干細胞增殖及遷移能力，同時降低其放療抵抗性，機制可能與其抑制HIF-1/NF-κB信號通路有關，值得進一步研究。

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（收稿日期：2018-12-19? 本文編輯：李亞聰）