EB病毒基因片段表達水平與鼻咽癌發病的關系

劉潔瓊 曹永清 李科 齊慧

[摘要] 目的 探討BCRF-1 mRNA表達水平與鼻咽癌發病相關性及其對免疫功能的影響。 方法 選取2017年1月～2018年5月于長沙市第一醫院（以下簡稱“我院”）就診的54例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）作為研究對象，選取我院同期就診的50例非腫瘤性鼻咽患者作為對照組。采用實時熒光定量PCR檢測BCRF-1 mRNA的表達水平，采用流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群。 結果 與對照組比較，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對表達顯著升高（P < 0.05）;TNM分期T3～T4期、N2～N3期鼻咽癌BCRF-1 mRNA相對表達量明顯高于T1～T2期、N0～N1期（P < 0.05）;BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+明顯低于BCRF-1 mRNA低表達組，而CD8+T細胞比例明顯高于BCRF-1 mRNA低表達組（均P < 0.05）。 結論 BCRF-1 mRNA表達可能與鼻咽癌TNM分期T、N有關，同時其高表達對患者免疫功能有抑制作用。

[關鍵詞] BCRF-1 mRNA;鼻咽癌;EB病毒;免疫功能;臨床病理特征

[中圖分類號] R730.231? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（b）-0113-04

Relationship between the expression level of EB virus gene fragment and the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma

LIU Jieqiong? ?CAO Yongqing? ?LI Ke? ?QI Hui

Department of Hematology and Oncology， the First Hospital of Changsha， Hu'nan Province， Changsha? ?410005， China

[Abstract] Objective To explore the correlation of BCRF-1 mRNA expression with nasopharyngeal carcinoma and its influence on immune function. Methods A total of 54 patients with nasopharyngeal carcinoma （nasopharyngeal carcinoma group） who were admitted to the First Hospital of Changsha （“our hospital” for short） from January 2017 to May 2018 were enrolled in the study. At the same time， 50 cases of non-neoplastic nasopharyngeal patients treated at the same time in our hospital were selected as the control group. The expression of BCRF-1 mRNA was detected by real-time PCR， the T cell subsets were determined by flow cytometry. Results Compared with control group， the relative expression of BCRF-1 mRNA was significantly increased （P < 0.05）. And the relative expression of BCRF-1 mRNA in TNM stage T3-T4 and N2-N3 was significantly higher than that in TNM stage T1-T2 and N0-N1 stage （P < 0.05）. The percentage of CD4+ T cells and CD4+/CD8+ in the high expression of BCRF-1 mRNA group was significantly lower than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group， while the proportion of CD8+ T cells was significantly higher than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group （all P < 0.05）. Conclusion The expression of BCRF-1 mRNA are may be related to TNM stage T and N of nasopharyngeal carcinoma， and its high expression can inhibit the immune function of patients.

[Key words] BCRF-1 mRNA; Nasopharyngeal carcinoma; EB virus; Immune function; Clinicopathological features

流行病學研究證實，我國部分地區2010～2016年鼻咽癌的發病可達283/10萬人～482/10萬人[1]。臨床上鼻咽癌能夠導致遠處轉移的發生，增加腫瘤患者的病死率風險，縮短患者總體生存時間[2-3]。在探討鼻咽癌發病機制的過程中發現不同的基因或者腫瘤相關蛋白的表達，能夠通過影響鼻黏膜上皮細胞的生物學特征，干預自身免疫監察作用，進而影響鼻咽癌發生發展的過程。EB病毒基因片段（BCRF-1）是EB病毒的重要開放編碼閱讀區，其能夠通過編碼VIL-10蛋白，進而導致鼻黏膜上皮細胞周期紊亂、加劇上皮細胞核DNA持續性異常擴增[4-5]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA在鼻咽癌患者中的表達情況，認為BCRF-1 mRNA表達的增加與鼻咽癌的早期發生密切相關[6]，但缺乏對于BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者自身免疫功能關系的研究。為了揭示BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌發生發展的關系，從而為臨床上鼻咽癌的診療提供理論方面的參考，本研究探討了BCRF-1 mRNA的表達及其與鼻咽癌患者病情的關系，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年5月長沙市第一醫院（以下簡稱“我院”）收治的鼻咽癌患者54例（鼻咽癌組）作為研究對象。納入標準：①均經病理檢查確診;②患者及家屬知情同意;③鼻咽癌組患者病理診斷符合《中國常見惡性腫瘤診治規范》[7]中關于鼻咽癌的診斷標準。排除標準：①合并其他惡性腫瘤;②既往有免疫系統疾病或近期服用過影響免疫系統的藥物;③研究前有放化療等抗腫瘤治療。選取我院同期就診的非腫瘤性鼻咽患者50例作為對照組。兩組受試者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。本研究獲得我院倫理委員會批準。

表1? ?兩組一般資料比較

1.2 分期標準

鼻咽癌的TNM分期按照中國鼻咽癌分期2017版與UICC/AJCC分期第8版標準[8]。T分期：Tx：原發腫瘤無法評估;T0：未發現腫瘤，但有EB病毒陽性且有頸轉移淋巴結;T1：腫瘤局限于鼻咽，或侵犯口咽和/或鼻腔，無咽旁間隙受累;T2：腫瘤侵犯咽旁間隙和/或鄰近軟組織受累（翼內肌、翼外肌、椎前?。?T3：腫瘤侵犯顱底骨質結構、頸椎、翼狀結構和/或鼻旁竇;T4：腫瘤侵犯至顱內，有顱神經、下咽、眼眶、腮腺受累和/或有超過翼外肌的外側緣的廣泛軟組織侵犯。其中T1期7例、T2期10例、T3期24例、T4期13例。N分期：Nx：無法評估區域淋巴結;N0：無區域淋巴結轉移;N1：單側頸部和/或咽后淋巴結轉移（不論側數，最大徑≤6 cm，且位于環狀軟骨下緣以上區域）;N2：雙側頸淋巴結轉移（最大徑≤6 cm，位于且環狀軟骨下緣以上區域）;N3：頸淋巴結轉移（不論側數，最大徑>6 cm和/或位于環狀軟骨下緣以下區域）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR檢測BCRF-1 mRNA表達? 采集患者的外周靜脈血，加入0.2 mL的氯仿，2～8℃冰凍離心機中離心（12 000 r/min，離心15 min，半徑為10 cm），反復1次洗滌RNA，棄上清，在管底部可見乳白色沉淀物，加入1 mL 75%乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入BCRF-1 mRNA和GAPDH的上下游引物、0.1% DEPC，使其終濃度均為20 pmol/μL，制備反應體系。RT-PCR擴增的條件與參數：48℃ 45 min，94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min 共40個循環;循環完畢后68℃延伸7 min。RT-PCR試劑盒購自寶生物技術有限公司（日本Takara）（批號：20110357）。BCRF-1基因引物上游5′-CAAGGACCAACTACAACC-3′，下游5′-TGCCTCTTCTTTAATTG-3′;內參GADPH引物上游5′-GGTGAAGCTCGGAGTCAACG -3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。結果按照2-ΔΔCt的方式進行表達。

1.3.2 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群? 采集患者清晨空腹血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，采用流式細胞儀雙標法進行T淋巴細胞的檢測。相關標記操作于5 mL抗凝管中進行，100 μL全血與CD4-FITC/CD8-PE抗體室溫反應25 min，采用紅細胞裂解液Optilyse C溶血素溶解紅細胞，PBS液體洗滌3遍，每次5 min，生理鹽水重新懸浮細胞，上機檢測。（FACS calibur流式細胞儀購自美國BD公司，threg檢測試劑盒購自羅氏檢測公司，貨號：20120387，稀釋度：1∶500）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組和對照組BCRF-1 mRNA表達水平比較

鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對表達量為（0.895±0.103），明顯高于對照組（0.355±0.097），差異有統計學意義（t = 24.470，P < 0.05）。見圖1。

M：Marker;1：對照組;2：鼻咽癌組

圖1? ?鼻咽癌組與對照組BCRF-1 mRNA PCR產物電泳圖

2.2 鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達與臨床病理特征的關系分析

TNM分期T3～T4期、N2～N3期的鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達量明顯高于TNM分期T1～T2期、N0～N1期（均P < 0.05）。見表2。

2.3 鼻咽癌患者中BCRF-1 mRNA的相對表達量與T淋巴細胞亞群的關系分析

依據本研究中患者BCRF-1 mRNA平均相對表達量，將鼻咽癌患者分為BCRF-1 mRNA高表達組（表達量>0.895）和BCRF-1 mRNA低表達組（表達量 ≤0.895）。與BCRF-1 mRNA低表達組比較，BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T細胞、CD4+/CD8+比例較低，而CD8+T細胞比例較高（均P < 0.05）。見表3。

表3? ?不同BCRF-1基因表達鼻咽癌患者T細胞亞群比較（x±s）

3 討論

在長期吸煙或者合并有相關家族史的患者中，鼻咽癌的發病風險較高，特別是在合并有EB病毒感染的人群中，鼻咽癌的發生率可進一步上升[9]?，F階段臨床上通過手術或者放療措施治療鼻咽癌，其能夠提高鼻咽癌的治療水平，延長鼻咽癌患者的總體生存時間[10-12]。但長期的隨訪研究證實，鼻咽癌治療后生存轉歸的改善仍然不明顯，治療后鼻咽癌患者的病情惡化速度仍然較快。而本研究對鼻咽癌發展過程中基因因素的探討，有助于揭示鼻咽癌的發生機制，并為鼻咽癌患者的臨床診療提供理論前提。

臨床上鼻咽癌的發病機制仍不清楚，不同病理性因素的改變，均有提高鼻黏膜上皮細胞異常增殖的風險，導致癌細胞轉錄水平的改變。EB病毒感染在促進鼻咽癌的發生過程中發揮了重要的作用，其能夠通過整合宿主細胞，增加鼻黏膜上皮細胞G1/S期的細胞比例，提高癌細胞的浸潤和黏附能力。而BCRF-1 mRNA作為EB病毒的非編碼開放閱讀區，其能夠通過分泌VIL-11蛋白，進而調控上皮細胞的增殖、凋亡及分化過程。相關的基礎研究也證實，BCRF-1 mRNA的表達能夠提高染色體DNA的擴增速度，并能夠通過甲基化或者磷酸化的修飾，降低癌細胞增殖過程中的基因錯配修復能力，促進癌基因的突變和癌細胞的擴增[13]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者生存預后的關系，發現BCRF-1 mRNA表達濃度的上升與鼻咽癌患者病死率或者總體生存時間密切相關[14]，但缺乏對于BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者T淋巴細胞亞群的關系研究。

本研究顯示，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA的表達與對照組比較，濃度明顯上升，提示了BCRF-1 mRNA的高表達能夠參與鼻咽癌的病情過程。通過匯集不同的相關文獻，筆者認為這主要與BCRF-1 mRNA以下幾個方面的病理性作用有關[15-16]：①BCRF-1 mRNA的上升能夠通過提高鼻黏膜上皮細胞內腫瘤信號通路的激活程度，激活AKT或者NF-κB，促進癌細胞的增殖;②BCRF-1 mRNA的上升能夠影響到鼻黏膜上皮細胞周期，導致癌細胞快速跨越G0期的能力明顯增加。楊璐等[17]研究者也認為，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達濃度可平均上升35%以上，特別是在中晚期鼻咽癌患者或者遠期生存時間較短的患者中，BCRF-1 mRNA的表達可進一步上升。本研究在探討相關因子與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系過程中，發現BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的TNM分期及淋巴結轉移密切相關，TNM分期晚或者已發生淋巴結轉移的患者，其BCRF-1 mRNA表達水平可明顯上升，這主要是由于BCRF-1 mRNA的表達能夠增加癌細胞浸潤能力，提高鼻黏膜上皮細胞浸潤深度，延長TNM分期;而BCRF-1 mRNA可以同時提高癌細胞對于鎖骨下或者頸部淋巴結的黏附能力，促進淋巴結轉移的發生。但部分研究者并不認為BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的淋巴結轉移有關[18-20]，這與本研究存在一定的差別，主要考慮與BCRF-1 mRNA的檢測靈敏度差別有關。最后本研究發現，BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T淋巴細胞比例明顯下降，而CD8+T淋巴細胞明顯上升，提示BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的T淋巴細胞功能密切相關，這主要由于BCRF-1 mRNA能夠導致自身免疫逃逸的發生，并影響到樹突狀細胞的抗原提呈功能，進而導致T淋巴細胞亞群的改變[21-22]。

本研究的創新性在于探討了BCRF-1 mRNA的表達與T淋巴細胞亞群的關系。綜上所述，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達明顯上升，BCRF-1 mRNA的表達與患者TNM分期或者淋巴結轉移密切相關，同時BCRF-1 mRNA的表達還能夠影響到患者的T淋巴細胞功能。

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（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：張瑜杰）