Box—Behnken設計—響應面法優選雪松松針中蛇床子素的提取工藝

2019-10-19 05:13:24范彬李琳石曉峰沈薇馬趣環劉東彥王新娣

中國藥房 2019年3期

范彬李琳石曉峰沈薇馬趣環劉東彥王新娣

中圖分類號 R932 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0359-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.16

摘要目的：優選雪松松針中蛇床子素的提取工藝。方法：采用高效液相色譜法測定蛇床子素含量。在單因素考察的基礎上，以乙醇體積分數、提取時間、料液比為考察因素，以蛇床子素含量為響應值，采用Box-Behnken設計-響應面法優選雪松松針中蛇床子素的提取工藝，并進行驗證試驗。結果：確定的最佳提取工藝為乙醇體積分數88%，料液比1 ∶ 20（g/mL），提取2次、每次57 min。在此工藝條件下，提取得到蛇床子素的平均含量為0.675 7 mg/g（RSD=1.78%，n=3），與預測值0.680 9 mg/g的相對誤差為0.59%。結論：優選的最佳提取工藝方法簡便、可行，可用于雪松松針中蛇床子素的提取。

關鍵詞雪松松針；蛇床子素；提取工藝；Box-Behnken設計；響應面法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of osthole from the pine needles of Cedrus deodara. METHODS： HPLC method was adopted to determine the content of osthole. Based on single factor test， ethanol volume fraction， extraction time and material-solvent ratio were selected as influential factors， and the content of osthole was selected as response value. Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the extraction technology of osthole in pine needles of C. deodara. Validation test was conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows as ethanol volume fraction of 88%， material-solvent ratio of 1 ∶ 20 （g/mL）， extracting for 2 times， lasting for 57 min each time. Under this technology， average content of osthole was 0.675 7 mg/g （RSD=1.78%， n=3）， and the relative error of which to predicted value 0.680 9 mg/g was 0.59%. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology is simple and feasible，and it can be used for the extraction of osthole from the pine needles of C. deodara.

KEYWORDS Pine needles of Cedrus deodara； Osthole； Extraction technology； Box-Behnken design； Response surface methodology

雪松[Cedrus deodara （Roxb.） G.Don.]又名喜馬拉雅雪松、喜馬拉雅杉、香柏，是松科（Pianaceae）雪松屬（Cedrus Trew）植物，其針葉藥用歷史悠久，其中的主要化學成分為揮發油、黃酮類、苯丙素類、有機酸類、三萜類、甾體類、多糖及針葉膠類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗褐變、抗菌等藥理活性[1-2]。本課題組前期對雪松松針進行了諸多研究，如采用高效液相色譜法/紫外-可見分光光度法測定雪松不同部位中4個黃酮類化合物、5種酚酸類成分以及原花青素的含量[3-5]；并且通過對雪松松針中丹皮酚、蛇床子素、和厚樸酚、厚樸酚4個有效成分的含量測定[6]，發現其中蛇床子素含量較高。

蛇床子素又稱甲氧基歐芹素，屬于香豆素類化合物，具有較強的藥理活性，對心腦血管系統、內分泌系統以及免疫系統等多種疾病均具有較為明顯的藥理作用[7]，是一個值得進一步研究和開發利用的活性成分。為了從雪松松針中提取純化蛇床子素，本試驗擬采用高效液相色譜法測定蛇床子素含量，在單因素考察的基礎上，采用Box-Behnken設計-響應面法優選雪松松針中蛇床子素的提取工藝，為后續的研究提供試驗參考。

1 材料

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、可變波長掃描紫外檢測器、1100化學工作站和標準手動進樣器（美國Agilent公司）；AE260萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-4電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

雪松松針于2008年6月采自甘肅省蘭州市，經甘肅省醫學科學研究院何福江研究員、石長栓副研究員鑒定為松科雪松屬植物雪松的針葉，將藥材陰干并保存于陰涼庫，待用；蛇床子素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-11123014，純度：>98%，供含量測定用）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液精密稱取蛇床子素對照品4.4 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，即得質量濃度為0.44 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇20 mL，水浴回流提取2 h，過濾，濾液定容至25 mL棕色量瓶中，即得。

2.2 色譜條件

參考文獻[8-10]設置。色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（80 ∶ 20，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：322 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取“2.1”項下對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，供試品溶液與對照品溶液中蛇床子素色譜峰的保留時間一致，與相鄰峰間的分離度均>1.5，理論板數按蛇床子素計不低于3 000，色譜圖見圖1。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液20、40、80、120、160、200 μL，分別置于1 mL量瓶中，用95%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成系列質量濃度的蛇床子素對照品溶液，然后按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（y）、蛇床子素的質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）繪制標準曲線，得到蛇床子素的標準曲線方程為y=47.477 507 5x+34.644 78（r=0.999 6），表明蛇床子素質量濃度在8.8～88.0 μg/mL范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗精密吸取新鮮配制的質量濃度為35.20 μg/mL的蛇床子素對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，蛇床子素峰面積的RSD=0.82%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.2”項下色譜條件分別進樣20 μL，記錄峰面積。結果，蛇床子素的平均含量為0.519 6 mg/g，RSD=2.09%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.4.4 穩定性試驗精密吸取同一份供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、10、24 h后，按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，記錄峰面積。結果，蛇床子素峰面積的RSD=2.09%（n=7），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內基本穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗精密稱取雪松松針粉末（10～20目） 0.5 g，共9份，按樣品含量的80%、100%和120%分別加入蛇床子素對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，記錄峰面積。結果，蛇床子素的平均加樣回收率為101.98%，RSD=1.57%（n=9），表明該方法準確度較好，結果見表1。

2.5 單因素試驗

在預試驗的基礎上，分別對回流提取過程中影響雪松松針中蛇床子素含量的4個影響因素（提取時間、料液比、乙醇體積分數及提取次數）進行逐一考察。

2.5.1 提取時間對蛇床子素含量的影響精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，共5份，以95%乙醇作為提取溶劑，固定料液比為1 ∶ 20（g/mL），提取次數為1次，分別于水浴回流提取不同時間（30、60、90、120、150 min），然后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，測定峰面積并計算雪松松針提取液中蛇床子素的含量。結果，當提取時間為60 min時，雪松松針提取液中蛇床子素的含量最高，提取效果最好，故選擇30～90 min的提取時間進行Box-Behnken設計試驗。提取時間對蛇床子素含量的影響結果見圖2a。

2.5.2 料液比對蛇床子素含量的影響精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，共5份，以95%乙醇為提取溶劑，提取次數為1次，設置不同料液比（1 ∶ 8、1 ∶ 12、1 ∶ 16、 1 ∶ 20、1 ∶ 24，g/mL），于水浴回流提取60 min，按“2.1.2”項下方法制供試品溶液后，再按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，測定峰面積并計算雪松松針提取液中蛇床子素含量。結果，當料液比為1 ∶ 20時，雪松松針提取液中蛇床子素的含量最高，提取效果最好，故選擇料液比為 1 ∶ 16～1 ∶ 24進行Box-Behnken設計試驗。料液比對蛇床子素含量的影響結果見圖2b。

2.5.3 乙醇體積分數對蛇床子素含量的影響精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，共5份，選擇不同體積分數（60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇，固定料液比為1 ∶ 20（g/mL），提取次數為1次，于水浴回流提取60 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，測定峰面積并計算雪松松針提取液中蛇床子素含量。結果，當乙醇體積分數為90%時，雪松松針提取液中蛇床子素含量最高，提取效果最好，故選擇80%～100%的乙醇體積分數進行Box- Behnken設計試驗。乙醇體積分數對蛇床子素含量的影響結果見圖2c。

2.5.4 提取次數對蛇床子素含量的影響精密稱取雪松松針粉末（10～20目）1.0 g，共3份，加入90%乙醇20 mL，選擇不同提取次數（1、2、3次）于水浴回流提取，每次60 min，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項下色譜條件進樣20 μL，測定峰面積并計算雪松松針提取液中蛇床子素的含量。結果，水浴回流提取2次時，雪松松針提取液中蛇床子素的含量已能達到提取3次后的90%以上，故最終固定提取次數為2次進行后續的試驗。提取次數對蛇床子素含量的影響結果見圖2d。

2.6 Box-Behnken設計-響應面法優化試驗

2.6.1 方案設計及試驗結果根據單因素試驗結果，選擇提取時間（A）、料液比（B）、乙醇體積分數（C）為考察因素，固定提取次數為2次，以雪松松針提取液中蛇床子素含量（R）為響應值，應用Box-Behnken設計進行3因素3水平的響應面試驗，因素與水平見表2，Box-Behnken 設計與結果見表3。

2.6.2 模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert.V 8.0.6軟件對表3的數據進行回歸分析，以蛇床子素含量（R）為響應值對提取時間（A）、料液比（B）、乙醇體積分數（C）進行多元線性回歸和二次多項式方程擬合，得回歸方程為：R=-5.219 22+0.017 496A+0.160 260B+0.087 407C-2.266 67×10-4AB-5.441 67×10-5AC-5.100 00×10-4BC-7.29 528×10-5A2-2.611 41×10-3B2-4.240 75×10-4C2（R2=0.989 7），方差分析結果見表4。

由表4可知，模型的P<0.000 1，表明回歸方程擬合度良好，具有極顯著的影響；失擬項P=0.471 2>0.05，表明數據沒有異常點。以雪松松針中蛇床子素含量為響應值時，一次項A和C、交互項AB、二次項A2、B2、C2對試驗結果有極顯著的影響（P<0.001），一次項B、交互項BC有高度顯著的影響（P<0.01），交互項AC有顯著的影響（P<0.05），表明所得回歸方程能夠很好地預測蛇床子素含量隨各響應因子的變化。

2.6.3 響應面分析根據回歸模型作出相應的響應面曲線圖和等高線圖，通過響應面曲線的變化情況及等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對蛇床子素含量的影響，結果見圖3。

由圖3可知，提取時間和料液比的交互作用顯著性強；提取時間與乙醇體積分數、料液比與乙醇體積分數的交互作用不顯著。蛇床子素含量隨提取時間及料液比的變化呈現出由低到高再降低的趨勢，因此在合適的溶劑、提取時間及料液比下，蛇床子素含量會有極大值，且應位于曲面的頂部。

2.6.4 驗證試驗通過軟件Design-Expert.V8.0.6軟件對模型求解方程，得到最優提取工藝條件：乙醇體積分數為87.58%，料液比為1 ∶ 19.67 g/mL，回流提取2次、每次56.68 min，在該條件下蛇床子素含量達到最大值（0.680 9 mg/g）。考慮到實際操作，將蛇床子素的提取工藝調整如下：乙醇體積分數為88%，料液比為1 ∶ 20 （g/mL），回流提取2次、每次57 min。在此條件下平行進行3次驗證試驗，測得雪松松針提取液中蛇床子素的平均含量為0.675 7 mg/g（RSD=1.78%，n=3），與模型預測值0.680 9 mg/g的相對誤差為0.59%，表明該工藝條件穩定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本試驗參照文獻方法[8-10]建立了雪松松針提取液中蛇床子素含量測定的高效液相色譜法，在相同色譜條件下，分別考察了檢測波長在249[11]、294[6]、297[12]、310[13]、322 nm[14]處蛇床子素的色譜圖。結果顯示，蛇床子素在322 nm波長處的色譜分離度最好，且干擾峰少、響應值最高，故最終選用322 nm作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的選擇

蛇床子素屬于香豆素類化合物，其提取制備方法有水煎醇沉法、醇提水沉法和氯仿復提法等。張榮等[11]通過試驗比較后，認為醇提水沉法和氯仿復提法是蛇床子素的良好提取方法，且其中醇提水沉法適合作為大生產或實驗室研究的提取方法。在前期研究中，筆者首先通過對不同溶劑（乙醇、甲醇、水）進行篩選，發現在3種溶劑中以乙醇的提取效果最好，且其體積分數的高低對蛇床子素含量有很大影響，通過本試驗遴選出88%乙醇作為提取溶劑時效果最好。

4 結語

響應面法雖試驗次數多于正交試驗，但其能建立連續變量曲面模型，試驗方法更直觀、精確。本研究在單因素考察的基礎上，采用 Box-Behnken設計-響應面法優化得到了雪松松針中蛇床子素最佳提取工藝：乙醇體積分數為88%，料液比為1 ∶ 20（g/mL），回流提取2次、每次57 min。經驗證，在最優工藝條件下測得值與與模型預測值的相對誤差僅為0.59%，表明該提取工藝條件穩定、可靠，可用于雪松松針中蛇床子素的提取。

參考文獻

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