單因素試驗結合Box—Behnken設計—響應面法優化甘草中黃酮類成分的提取工藝

袁思文 劉育辰 劉剛 郝杰 金文淵

中圖分類號 R927.2；R932 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0355-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.15

摘 要 目的：優化甘草中黃酮類成分的提取工藝。方法：以芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷4種黃酮類成分的總提取量為考察指標，以提取溶劑種類（水、乙醇）及其不同體積分數、加入量與提取時間為考察因素，在單因素試驗基礎上，運用Box-Behnken設計-響應面法優化甘草中黃酮類成分的提取工藝，并進行驗證試驗。結果：優化的提取工藝為以50%乙醇為提取溶劑，在0.200 g藥材中加入50 mL，超聲提取50 min。在驗證試驗中，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷提取量分別為10.733 0、27.784 9、3.441 9、0.429 1 mg/g（RSD均<3.0%，n=3），4種黃酮類成分平均總提取量為42.388 9 mg/g，與預測值（42.173 2 mg/g）的相對誤差為0.52%（n=3）。結論：優化的提取工藝簡便、快捷、穩定，可用于甘草中黃酮類成分的提取。

關鍵詞 甘草；黃酮類成分；芹糖甘草苷；甘草苷；芹糖異甘草苷；芒柄花苷；Box-Behnken設計-響應面法；提取工藝；優化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of the flavonoids from Glycyrrhiza uralensis. METHODS： Using total contents of four flavonoids， liquiritinapioside， glycyrrhizin， isoliquiritin apioside and formononetin as indexes， types and volume fractions of extraction solvents （water， ethanol）， volume of addition and extraction time as factors， based on single factor experiment， Box-Behnken design-response surface method was used to optimize the extraction technology of flavonoids from G. uralensis. Validation test was also conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was 50 mL 50% ethanol as extraction solvent， 0.200 g G. uralensis， ultrasonic extraction for 50 min. In validation test， the extraction amounts of liquiritinapioside， glycyrrhizin， isoliquiritin apioside and formononetin were 10.733 0， 27.784 9， 3.441 9， 0.429 1 mg/g， respectively （all RSDs<3.0%， n=3）. The average total extraction amount of four flavonoids was obtained was 42.388 9 mg/g， the relative error of which to predicted value （42.173 2 mg/g） was 0.52% （n=3）. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology is simple， rapid and stable， and can be used for the extraction of flavonoids from G. uralensis.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis； Flavonoids； Liquiritinapioside； Glycyrrhizin； Isoliquiritin apioside； Formononetin； Box- Behnken design-response surface methodology； Extraction technology； Optimization

甘草為豆科甘草屬植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiz glabral L.）的干燥根和根莖，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效[1]。以其制成的制劑在臨床上主要用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽痰多、脘腹及四肢攣急疼痛、癰腫瘡毒，還可緩解其他藥物的毒性、烈性[2]。現代藥理研究表明，甘草具有鎮咳、抗病毒、抗腫瘤活性以及肝保護作用[3]。甘草中含有黃酮類、皂苷類、香豆素類、二苯乙烯類以及糖類成分[4]，其中甘草總黃酮具有抗炎、抗病毒、抗氧化、強心、鎮靜和鎮痛作用，并對人類免疫缺陷病毒有較強的抑制增殖作用[5]。黃酮類化合物是甘草中已知的主要活性物質，其中甘草苷的抗抑郁作用顯著[6]，芹糖異甘草苷有顯著的鎮咳效果[7]，而且以芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷等為代表，可以用于不同基源甘草的鑒別研究[8]。響應面法（Response surface methodology，RSM）是一種常用于優化提取工藝條件的方法[9]，具有試驗次數少、精度高、預測值精準的優點[10]，已廣泛應用于百花蛇舌草[9]、枳殼[11]、酸藤子[12]、桑葉總黃酮[13]、仙鶴草[14]、山茱萸[15]等中藥提取工藝的研究。本試驗選擇芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷作為黃酮類成分的代表，以這4種成分的總提取量作為考察指標，采用Box-Behnken設計-響應面法優化甘草中黃酮類成分的提取工藝，為甘草中黃酮類成分的進一步開發、利用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EX225DZH十萬分之一天平[美國奧豪斯儀器（上海）有限公司）]；LC-2030CN高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

甘草藥材于2016年10月采自蘭州市榆中縣，經貴陽中醫學院劉育辰副教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖；芹糖甘草苷（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：20170710，純度：98%）；甘草苷（批號：CHB160307，純度：98%）、芹糖異甘草苷（批號：AB17060712，純度：98%）對照品均購于成都埃法生物科技有限公司；芒柄花苷對照品（貴州迪大生物科技有限責任公司，批號：GZDD-0721，純度：99.62%）；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 4種成分的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 本課題組前期研究建立的色譜條件[8]如下：色譜柱為CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，18%→21%A；12～21 min，21%→23%A；21～30 min，23%→25%A；30～40 min，25%→30%A；40～50 min，30%→35%A；50～55 min，35%→40%A；55～56 min，40%→100%A；56～70 min，100%A）；檢測波長為265 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；對照品進樣體積為10 μL，供試品進樣體積為20 μL。

取“2.1.2”項下供試品溶液和混合對照品溶液進樣分析，結果，理論板數按芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷峰計均大于9 000；保留時間分別為12.09、13.19、26.79、28.69 min，表明各成分在此條件下基線分離良好。色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液。分別精密稱取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷對照品適量，加50%乙醇溶解，配制成質量濃度分別為0.080 4、0.052 5、0.032 0、0.004 3 mg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液。精密稱取甘草粉末0.200 g，置于具塞錐形瓶中，加入提取溶劑50%乙醇50 mL，超聲提取（功率：200 W，頻率：40 kHz）50 min。放置至室溫后稱質量并用50%乙醇補足質量，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.3 線性關系考察 取“2.1.2”項下的混合對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各對照品進樣量（μg）為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。將上述混合對照品溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）約為10倍時的進樣量確定為定量限。線性關系及定量限結果見表1。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷峰面積的RSD分別為0.04%、0.05%、0.11%、0.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷含量的平均值分別為9.135 5、30.829 0、2.442 8、0.358 9 mg/g，RSD分別為0.73%、1.15%、1.57%、1.60%（n=6），表明重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液6份，分別于室溫下放置0、3、5、8、13、20、24 h后進樣測定。結果表明，供試品溶液中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷峰面積的RSD分別為0.91%、0.62%、0.51%、1.43%（n=7），表明供試品溶液中4種成分的含量在室溫下放置24 h內穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的藥材樣品6份，每份約0.100 g，分別加入芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、芒柄花苷對照品溶液各適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率和RSD值。結果，4種成分的平均回收率為97.77%～102.08%，RSD為0.46%～1.87%（n=6），詳見表2。

2.2 單因素試驗考察

2.2.1 提取溶劑 稱取0.200 g甘草粉末2份，分別以50 mL 70%乙醇、水溶液為提取溶劑進行超聲提取（功率：200 W ，頻率：40 kHz，下同）30 min，同時做平行試驗一次。以4種黃酮類成分總提取量為指標，結果以70%乙醇為提取溶劑時較高，經綜合考慮，選擇乙醇為提取溶劑，詳見表3。

2.2.2 提取溶劑的體積分數 稱取0.200 g甘草藥材粉末2份，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50 mL，超聲提取30 min，同時做平行試驗一次，測定各成分提取量。結果以乙醇體積分數為50%時，4種黃酮類成分的總提取量最大，詳見表4。

2.2.3 提取溶劑加入量 稱取0.200 g甘草藥材粉末2份，分別加入30、40、50、60、70 mL的50%乙醇溶液，超聲提取30 min，同時做平行試驗一次。測定4種黃酮類成分的提取量。結果以加入40 mL 50%乙醇溶液進行提取時，4種黃酮類成分的總提取量最大，詳見表5。