正交試驗優選鐵皮石斛生根培養基

陳 爾，王華新，陳寶玲，楊舒婷，蘇莉花

（廣西壯族自治區林業科學研究院，南寧 530002）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）又名黑節草、鐵皮蘭，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生附生型草本植物。其藥用價值獨特，是石斛屬中的極品。鐵皮石斛自然分布雖廣，但生境苛刻且因其種子在自然條件下自我繁殖能力極低，加上過度采挖，導致自然資源日漸枯竭。目前，通過組織培養技術已成功獲得組培苗，但組培苗存在移栽成活率偏低的問題[1-3]。在鐵皮石斛組織培養中，生根培養是一個重要環節，組培苗根系的長勢直接影響其移栽成活率，因此，研究影響鐵皮石斛生根培養條件的因素，從中優選鐵皮石斛生根培養條件，對提高組培苗移栽成活率具有十分重要的意義[4]。

植物生長調節劑、糖源、碳源、天然添加物、培養條件、pH 值及培養基種類等均是影響鐵皮石斛組培苗生根的因素。關于生長素配比、活性炭用量、天然添加物及基本培養基等因素有較多的研究[1-2，5]，且大多限于單一因素的影響作用。本試驗以MS為基本培養基，采用L9（33）正交試驗設計，研究生長素NAA、活性炭和香蕉汁對鐵皮石斛生根培養的影響，優化鐵皮石斛生根培養條件，旨在為鐵皮石斛規?；a提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的鐵皮石斛組培苗由廣西林科院園林花卉與森林旅游研究所自主培育。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗采用L9（33） 正交設計，選用生長素NAA、活性炭和香蕉汁作為參試因素，不考慮因素間的交互作用，各因素隨機排列（表1）。

表1 鐵皮石斛生根培養正交設計Tab.1 Orthogonal design of rooting culture of Dendrobium candidum

1.2.2 基本培養基

以MS 為基本培養基，所有培養基均加蔗糖2.5%～3.0%、瓊脂4.6 g∕L，pH值為5.6～5.8。

1.2.3 生根培養

在超凈工作臺上，選取苗高2.5～4.0 cm、葉3～4 片、葉色濃綠且具頂端生長點的鐵皮石斛無菌苗，切去其原有的根，接種于上述生根培養基中，按2苗∕叢接種，每個培養瓶接種5叢，每個處理接種10瓶，重復3次。

1.2.4 培養條件

接種后的培養基置于溫度（25+1）℃、光照強度2 000～3 000 lx、光照時間12 h∕d 的光照培養室內培養。

1.2.5 統計方法

接種60 d 后統計每株苗平均生根數及平均根長。平均生根數（條∕株）＝平均根長（cm）＝

1.2.6 數據分析

統計結果經Excel 2007電子表格處理后，再用DPS 7.05軟件進行直觀分析和方差分析，多重比較采用鄧肯新復極差檢驗法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛生根培養正交試驗結果

鐵皮石斛生根培養正交試驗結果表明（表2），9個處理的平均生根數和平均根長存在顯著差異（P＜0.05），且都以處理4（MS+NAA 2.0 mg∕L+活性炭1.0 g∕L+香蕉汁150 g∕L）表現最好，平均生根數達6.3條∕株，平均根長為3.5 cm；平均生根數最少的為處理5（MS + NAA 2.0 mg∕L + 活性炭3.0 g∕L+香蕉汁50 g∕L）和處理9（MS+NAA 3.0 mg∕L+活性炭5.0 g∕L+香蕉汁50 g∕L），均為3.8 條∕株；平均根長最短的為處理2（MS+NAA1.0mg∕L+活性炭3.0g∕L+香蕉汁100g∕L），為1.7 cm。

表2 鐵皮石斛組培苗生根培養正交試驗結果Tab.2 Orthogonal experimental results of rooting culture of Dendrobium candidum

2.2 鐵皮石斛平均生根數（X）和平均根長（Y）的直觀分析

鐵皮石斛平均生根數和平均根長的直觀分析見表3。判斷參試因素對評價指標影響的主次順序主要通過比較極差（R）大小來實現，極差最大者為主要影響因素。通過比較極差大小可知，影響鐵皮石斛平均生根數3個因素的主次順序為C（香蕉汁）＞B（活性炭）＞A（NAA）；影響鐵皮石斛平均根長3個因素由主到次的順序為B＞C＞A。

表3 鐵皮石斛平均生根數和平均根長的直觀分析Tab.3 Visual analysis of average root number and average root length of Dendrobium candidum

2.3 鐵皮石斛平均生根數（X）和平均根長（Y）的方差分析

對不同處理的平均生根數和平均根長進行方差分析（表4）。因素C（香蕉汁）對鐵皮石斛平均生根數影響最大，與因素A（NAA）和因素B（活性炭）的影響差異達到了顯著水平（P＜0.05）；因素B對鐵皮石斛平均根長影響最大，與因素A和因素C的影響差異達到了顯著水平（P＜0.05）。方差分析的結果與直觀分析的結果一致。

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis

2.4 影響鐵皮石斛平均生根數（X）和平均根長（Y）的各因素水平間的趨勢圖

影響鐵皮石斛平均生根數的因素A（NAA）以2水平的平均生根數最多（5.033 3條∕株）；因素B（活性炭）以1水平的最多（5.1條∕株）；因素C（香蕉汁）以3水平表現最優（5.4條∕株）（表3）。影響鐵皮石斛平均根長的因素A以2水平表現最佳（2.633 3 cm）；因素B以1水平表現最優（3.133 3 cm）；因素C以3水平的最大（2.833 3 cm）。

根據表3作出因素與水平的趨勢圖，從圖中可快速直觀地確定出各因素的優化水平組合：平均生根數各因素的優化水平組合為A2B1C3，平均根長各因素的優化水平組合為A2B1C3（圖1）。

2.5 鐵皮石斛組培苗生根最優方案

綜合直觀分析、方差分析及各因素水平間多重比較的結果，以平均生根數和平均根長為指標，篩選出鐵皮石斛生根的最優水平組合為A2B1C3，即鐵皮石斛生根培養的最優培養基為：MS+NAA 2.0 mg∕L+活性炭1.0 g∕L+香蕉汁150 g∕L+白糖25 g∕L+瓊脂4.6 g∕L。

圖1 因素與水平趨勢圖Fig1.Trend of factors and levels

3 結論與討論

NAA 是植物組織培養中常用于誘導植物生根培養的生長素之一[6-8]，可促進植物不定根的形成?；钚蕴烤哂谐瑥姷奈侥芰Γ晌脚囵B基中的有害物質，以利于培養材料的生長[9-10]。香蕉汁作為有機添加物，常用于蘭科植物組培苗生根壯苗的培養[11]。本研究以MS 為基本培養基，采用L9（33）正交試驗設計，研究生長素NAA、活性炭和香蕉汁對鐵皮石斛生根培養的影響。結果表明：影響鐵皮石斛生根因素的主次順序為香蕉汁＞活性炭＞生長素NAA，鐵皮石斛生根最優培養基為MS+NAA 2.0 mg∕L+活性炭1.0 g∕L+香蕉汁150 g∕L，平均生根數達6.3條∕株，平均根長為3.5 cm。

本研究得出，香蕉汁為影響鐵皮石斛生根的主要因子，隨著香蕉汁用量的增加，鐵皮石斛生根數和根長也隨之增加，當香蕉汁用量為150 g∕L時鐵皮石斛的生根數和根長達到最大值，這一用量（即添加15%香蕉汁）較前人的研究結果要偏多些，趙興兵等[12]在鐵皮石斛壯苗生根培養期采用分階段添加5%、7.5%及10%的香蕉汁的方法，鐵皮石斛根長和平均生根數可獲得明顯提高，李宏楊等[13]研究得出，向鐵皮石斛生根培養基中添加10%香蕉汁對維持培養基pH 起一定的緩沖作用，有利于鐵皮石斛試管苗的伸長生長及根系發生，而李璐等[14]研究認為，培養基中添加香蕉汁對鐵皮石斛試管苗的生長沒有明顯的促進?；钚蕴繛橛绊戣F皮石斛生根的次要因子，隨著活性炭用量的增加，鐵皮石斛生根數和根長減少，說明過量的活性炭對鐵皮石斛生根起抑制作用，可能是過量的活性炭在吸附鐵皮石斛生根培養基中某些有害物質的同時，也吸附了有助于其生根的某些營養成分。生長素NAA 對鐵皮石斛生根的影響最小，隨著NAA 用量的增加，鐵皮石斛生根數和根長出現了先增后減的現象，說明植物生長調節劑用量有一定的范圍要求，過高或過低都不利于植物生長。NAA的濃度為2.0 mg∕L時，鐵皮石斛生根數和根長達最大值，與李宏楊等[13]的研究結果一致，唐桂香等[15]認為NAA濃度為0.5 mg∕L時，生根效果最好。研究結果的差異可能是因為本試驗屬于多因素綜合效應的研究，添加的活性炭對過高質量濃度的NAA 有一定的吸附，在培養過程中起到了弱化NAA 的作用，但香蕉汁用量偏多的原因尚不能明確，這3因素間既相互促進又相互制約，這其中的原理有待進一步研究。

鐵皮石斛種子在沒有添加任何植物生長調節劑的培養基上能完成萌芽、分化、生根這一過程，但生長周期較長。本研究通過加入能促進鐵皮石斛生根的因素，優化試驗設計方案，使其組培苗的生根數和根長獲得顯著提高，縮短培養時間，減少生產成本，又提高了鐵皮石斛組培苗的出瓶質量，為提高組培苗的移栽成活率提供保障，達到快速繁殖的目的。