夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

王蕊蕊，胡 穎，楊振德,2，郭春暉，彭 欣，鄭霞林，張海歐

（1.廣西大學(xué)林學(xué)院，南寧 530004；2.廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；4.攀枝花市森林病蟲(chóng)防治檢疫站，四川攀枝花 617000）

桉樹(shù)枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa），屬于膜翅目（Hymenoptera），小蜂總科（Chalcidoidea），姬小蜂科（Eulophidae），是嚴(yán)重危害桉屬植物枝葉的致癭性害蟲(chóng)[1]。該害蟲(chóng)起源于澳大利亞，最早于2000年在中東和地中海地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已擴(kuò)散至亞洲、歐洲、非洲、美洲及大洋洲的45 個(gè)國(guó)家，給桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桉樹(shù)枝癭姬小蜂的研究主要集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)和綜合治理等方面[3-4]，對(duì)桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的研究鮮有報(bào)道。

昆蟲(chóng)體內(nèi)棲居著種類繁多、數(shù)量巨大的微生物群落，這些微生物與宿主昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，形成了豐富多樣的種群結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、生殖、行為、抗性等方面都產(chǎn)生了顯著的影響，同時(shí)在害蟲(chóng)的防控、昆蟲(chóng)資源的利用及生物能源的生產(chǎn)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力[5-7]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，16S rDNA 基因序列分析技術(shù)、DGGE 技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因組學(xué)等已成為研究微生物較常用的方法，并得到了較傳統(tǒng)微生物分離鑒定法更為全面、準(zhǔn)確的菌群結(jié)構(gòu)信息，但不能解析哪些菌為可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)細(xì)菌，若想用生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證體內(nèi)細(xì)菌對(duì)宿主的生理功能和生態(tài)作用及開(kāi)發(fā)利用體內(nèi)細(xì)菌資源，仍需借助傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法。本研究運(yùn)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和16S r DNA 基因測(cè)序相結(jié)合的方法從夏季剛羽化的桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)分離細(xì)菌，研究其體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的種類組成，為后期探討體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)桉樹(shù)枝癭姬小蜂的作用提供菌株材料，進(jìn)而為利用體內(nèi)細(xì)菌開(kāi)發(fā)新的生物防控技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

試蟲(chóng)采自廣西大學(xué)林學(xué)院教學(xué)實(shí)踐基地（108°17′E，22°51′N）網(wǎng)棚中單株栽培的巨園桉（Eucalyptus grandis×E.tereticornis）DH201-2 植物上夏季剛羽化的桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)。

1.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)

參照劉寧等[8]的方法略有改進(jìn)，將20頭桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)在無(wú)菌的條件下用75%的酒精和1‰HgCl2消毒后，加1 mL 無(wú)菌水研磨成菌液，按照10 倍梯度稀釋法制成10-1～10-5不同濃度的菌液并均勻涂于NA 培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)72 h；挑取大小、顏色、形態(tài)等不同的菌落在NA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行四區(qū)劃線純化培養(yǎng)，將純化后的菌株接種于NA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA 基因的擴(kuò)增

采用Biospin 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）分別提取各細(xì)菌基因組DNA。使用細(xì)菌通用引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1 492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2 × EayTaqPCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技術(shù)有限公司）15 μL，ddH2O 12 μL，27 F（32 P）和1 492 R（32 P）各0.5 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；（94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）× 35 個(gè) 循 環(huán)，72 ℃10 min，4 ℃保溫。用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序結(jié)果在EzBioCloud （http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合RDP Classifier在線分析，選取各菌株的同源序列，采用ClustalX程序進(jìn)行匹配比對(duì)，使用MEGA 5.0 軟件中的Neighbor-Joining（NJ）法bootstrap 置信度1 000 次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[9-10]，依此來(lái)確定各菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌的分離純化

利用NA培養(yǎng)基分離夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)、顏色等特征共獲得17株不同的細(xì)菌（表1）。

2.2 菌株16S rDNA擴(kuò)增及序列分析結(jié)果

以提取的上述17 株不同的細(xì)菌基因組DNA 為模板擴(kuò)增16S rDNA基因，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，16S rDNA 基因片段大小均在1 500 bp 左右（圖1）。將測(cè)序得到的17 條序列在EzBioCloud（http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）進(jìn)行同源性比對(duì)，并結(jié)合RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)Classifier 分析發(fā)現(xiàn)，從夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)分離的17 株細(xì)菌分屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），共涉及15個(gè)屬，其中3株（DH10、DH11、DH12）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），DH1 屬于葡萄球 菌屬（Staphylococcus），DH2屬于泛菌屬（Pantoea），DH3屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），DH4屬于類諾卡氏屬（Nocardioides），DH5屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），DH6屬于壤球菌屬（Agrococcus），DH7 屬于微桿菌屬（Microbacterium），DH8 屬于短小桿菌屬（Curto-bacterium），DH9 屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），DH13屬于根瘤菌屬（Rhizobium），DH14 屬于Dyadobacter屬，DH15 屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）， DH16 屬于短狀桿菌屬（Brachybacterium），DH17 屬于微球菌屬（Micrococcus）（表2）。

表1 夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落特征Tab.1 Colony features of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

表2 夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA 序列比對(duì)結(jié)果Tab.2 16S rDNA sequence identification results of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

圖1 夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 16S rDNA PCR products of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 N-J phylogenetic tree of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer based on 16S rDNA sequences

對(duì)測(cè)序得到的夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）。結(jié)果表明夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌可歸入15 個(gè)屬，分別在進(jìn)化樹(shù)上形成了獨(dú)立的分支，其中DH2、DH3、DH5、DH9、DH13 形成以變形菌門(mén)為家族的分枝，DH2、DH3、DH5和DH9 分別屬于γ-變形菌綱的Erwiniaceae 的泛菌屬，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的假單胞菌屬，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）的不動(dòng)桿菌屬和黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）的寡養(yǎng)單胞菌屬，DH13 屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）的根瘤菌科（Rhizobiaceae）的根瘤菌屬；DH10、DH11、DH12、DH1 形成以厚壁菌門(mén)為家族的分枝，分別屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）的芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）的葡萄球菌屬；DH6、DH7、DH8、DH4、DH17、DH16 形成以放線菌門(mén)為家族的分支，分別屬于放線菌綱（Actinobacteria）的微桿菌科（Microbacteriaceae）的壤球菌屬、微桿菌屬、短小桿菌屬，類諾卡氏科（Nocardioidaceae）的類諾卡氏菌屬、微球菌科（Micrococcaceae）的微球菌屬，皮桿菌科（Dermabacteraceae）的短狀桿菌屬；DH14、DH15 形成以擬桿菌門(mén)為家族的分支，分別屬于噬纖維菌綱（Cytophagia）的噬纖維菌科（Cytophagaceae） 的Dyadobacter屬，黃桿菌綱（Flavobacteriia）的黃桿菌科（Flavobacteriaceae）的金黃桿菌屬。表明變形菌門(mén)和放線菌門(mén)是夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群，其中DH10、DH11、DH12為同一屬，親緣關(guān)系最近；DH6、DH7、DH8為同一科，親緣關(guān)系次之。

3 結(jié)論與討論

本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和16S r DNA基因測(cè)序相結(jié)合的方法分析了夏季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成，17 株細(xì)菌分屬于芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、類諾卡氏屬、不動(dòng)桿菌屬、壤球菌屬、微桿菌屬、短小桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、根瘤菌屬、Dyadobacter屬、金黃桿菌屬、短狀桿菌屬、微球菌屬，共15個(gè)屬。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，5株細(xì)菌屬于變形菌門(mén)，6 株細(xì)菌屬于放線菌門(mén)，4 株細(xì)菌屬于厚壁菌門(mén)，2株細(xì)菌屬于擬桿菌門(mén)，變形菌門(mén)和放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。已有研究表明，稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）幼蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)群同樣也為變形菌門(mén)和放線菌門(mén)[9-10]。

前期利用相同的方法對(duì)同一地點(diǎn)同一寄主植物上采集的冬季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離，共獲得11 株細(xì)菌，分別為芽孢桿菌屬3株，微球菌屬2株，葡萄球菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、微桿菌屬、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）各1 株，厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群[11]。夏冬兩季桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的種類組成存在明顯的不同，可能是由于桉樹(shù)枝癭姬小蜂的生理代謝和生命周期不同造成的。俞英豪[12]對(duì)春秋兩季大青葉蟬（Cicadella viridis）腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其腸道優(yōu)勢(shì)菌群存在較大的差異。楊志波等[13]研究發(fā)現(xiàn)越夏期和越冬期意大利蜜蜂（Apismellifera ligustica）腸道細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。

一些研究表明，葡萄球菌可對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生積極的影響，假單胞菌可提高宿主的免疫反應(yīng)，不動(dòng)桿菌在宿主體內(nèi)可參與營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程，短狀桿菌和泛菌屬可增強(qiáng)宿主的抗性，寡養(yǎng)單胞菌對(duì)角蛋白有一定的降解能力，根瘤菌和假單胞菌具有水解纖維素的能力，協(xié)助宿主合成碳氮類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14-21]。本研究在桉樹(shù)枝癭姬小蜂雌成蟲(chóng)體內(nèi)也分離到了葡萄球菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、短狀桿菌屬、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和根瘤菌屬細(xì)菌，這些細(xì)菌是否在桉樹(shù)枝癭姬小蜂的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、抗性等方面發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。