腎癌組織中原鈣黏蛋白-10甲基化狀態及臨床意義

林英立 李艷麗 梁杰 趙炎

腎癌是泌尿系統中的常見腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，在組織學上以透明細胞癌為主[1-2]。腎癌發生、發展的分子機制非常復雜，其中抑癌基因的失活起著重要作用。研究發現，表觀遺傳學改變在抑癌基因的失活過程中具有重要作用，包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和非編碼RNA等；而DNA甲基化最為常見，可作為腫瘤早期診斷、療效監測及預后判斷的分子標志物[3-5]。原鈣黏蛋白-10（PCDH10）是PCDH家族的一員，在細胞的正常生長發育過程中發揮著重要作用。腫瘤學研究表明，過表達的PCDH10具有抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用，DNA甲基化是PCDH10失活的主要因素[6-7]。本研究對腎癌組織中PCDH10甲基化狀態及臨床意義作一探討。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年1月至2011年1月在本院接受腎癌根治術的78例腎癌患者為研究對象，其中男49例，女 29 例；年齡 55～78[66.5（61，72）]歲；參照 2010 年美國癌癥聯合委員會（AJCC）腎癌TNM分期：T138例，T217例，T320例，T43例；Fuhrman分級：G131例，G216例，G321例，G410例；局部淋巴結轉移14例。納入標準：（1）首次發現腎癌；（2）單一腎癌，未合并其他腫瘤；（3）術前影像學檢查診斷為腎臟惡性腫瘤，術后組織病理學診斷為透明細胞癌；（4）術前未接受過任何形式的抗腫瘤治療。所有患者隨訪至術后60個月或死亡，排除未能完成隨訪者。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 標本收集 收集78例腎癌患者的癌組織標本及其中38例T1期患者癌旁正常腎組織標本（距離腫瘤邊緣2cm外）。所有標本在術中切取，迅速置于液氮中，存于-80℃冰箱內備用。

1.3 DNA提取與甲基化特異性PCR（MSP） 使用Dneasy Tissue Kit（69504，德國Qiagen公司）并嚴格按照說明書提取組織DNA。按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（D5005，美國Zymo Research公司）試劑盒說明進行DNA亞硫酸氫鈉修飾并純化，分別應用甲基化和非甲基化引物進行PCR。甲基化引物：PCDH10正義5′-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3′，PCDH10 反義 5′-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3′；非甲基化引物：PCDH10 正義 5′-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3′，PCDH10 反義 5′-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3′。反應條件：95℃預變性5min；再進行35個循環的擴增反應，反應程序為 95℃變性 30s，60℃退火 1min，72℃延伸30s；然后72℃延伸10min；最后4℃保溫[8-9]。反應結束后取10μl產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像分析系統照相，結果以是否出現特異性甲基化或非甲基化條帶表示。僅應用甲基化引物擴增出產物條帶判斷為存在完全DNA甲基化，僅應用非甲基化引物擴增出產物條帶判斷為不存在DNA甲基化，若同時出現擴增產物條帶則表明存在部分DNA甲基化；完全DNA甲基化和部分DNA甲基化均被認為DNA甲基化陽性[8-9]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 8.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較患者5年總生存率。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌組織與癌旁正常組織中PCDH10甲基化陽性率比較 腎癌組織PCDH10甲基化陽性率為73.1%（57/78），明顯高于癌旁正常組織的 21.1%（8/38），差異有統計學意義（P＜0.05）。腎癌組織PCDH10甲基化狀態的電泳圖，見圖1。

圖1 腎癌組織PCDH10甲基化狀態的電泳圖（例55、56、57出現甲基化；例58、59未出現甲基化；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 腎癌組織PCDH10甲基化狀態與患者臨床特征的關系 腎癌組織PCDH10甲基化陽性與患者性別、年齡無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與腫瘤T分期、Fuhrman分級、淋巴結轉移有關，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 腎癌組織PCDH10甲基化狀態與患者臨床特征的關系[例（%）]

2.3 腎癌組織PCDH10甲基化與患者5年總生存率的關系 78例腎癌患者中，腎癌組織PCDH10甲基化57例，PCDH10非甲基化21例。甲基化組5年總生存率為73.7%（42/57），明顯低于非甲基化組的95.2%（20/21），差異有統計學意義（P＜0.05），生存曲線見圖2。

3 討論

PCDH10基因位于人類染色體4q28.2，早期研究認為其主要在神經系統中表達，參與神經發育、細胞識別和神經通路的形成等。但近年來研究發現，PCDH10在成人正常組織中廣泛表達，且在腫瘤組織中表達減少或缺失，對多種腫瘤具有抑癌基因的功能[6,10-11]。抑癌基因的失活具有多種機制，包括雜合性缺失、單倍體不足、基因印記、多態性和DNA甲基化等[12-13]。

圖2 腎癌組織PCDH10甲基化與未甲基化患者5年總生存率的生存曲線

DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學改變。本研究所采用的MSP是目前應用最廣泛的甲基化檢測方法，具有較高的靈敏度和特異度[14-15]。為研究PCDH10甲基化與腎癌發生的關系，筆者檢測了PCDH10在腎癌組織和癌旁正常腎組織中的甲基化狀態，結果發現PCDH10在腎癌組織中的甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義，提示PCDH10甲基化與腎癌的發生密切相關。一項基礎研究顯示，在肝癌細胞中上調PCDH10表達能抑制PI3K/Akt通路，進而促進細胞的凋亡，抑制細胞增殖[10]；在多發性骨髓瘤的基礎研究中，也發現了PCDH10抑制細胞增殖的現象[11]。DNA甲基化是PCDH10表達下調的主要原因。

有研究發現在乳腺癌、前列腺癌組織中PCDH10甲基化與患者腫瘤大小、分級和轉移等密切相關，PCDH10甲基化是腫瘤進展的促進因素[7，9]。為探討腎癌組織PCDH10甲基化的臨床意義，筆者分析了PCDH10甲基化與患者性別、年齡、腫瘤T分期、Fuhrman分級和淋巴轉移的關系，結果發現在T分期及Fuhrman分級較高、有淋巴轉移的患者中，PCDH10甲基化明顯增加。可見，PCDH10甲基化與腎癌的發生、發展密切相關。關于腎癌的預后，目前尚缺乏有效的預測指標，主要依靠臨床分期來預測患者的生存率，但其準確性不能滿足臨床的要求。精確區分哪些患者在手術治療后預后較差、需要進一步治療是目前臨床上急需解決的問題。為進一步探討腎癌組織PCDH10甲基化與患者預后的關系，筆者對腎癌患者進行了5年術后隨訪，結果發現PCDH10甲基化組5年總生存率明顯低于未甲基化組，提示腎癌組織PCDH10甲基化陽性與患者預后不良有關；這與乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤中的研究結果相似[7-8,16]。

綜上所述，腎癌組織PCDH10甲基化陽性率較高，與腎癌的發生、發展及患者預后不良相關。PCDH10甲基化指標有可能成為腎癌診斷與預后預測的分子標志物。