冰片對替莫唑胺抗大鼠腦膠質瘤促進作用的研究

范成普 陳才紅 杜杭根 陳景南

神經膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，其發病率、復發率和病死率均較高。目前手術切除+放化療是神經膠質瘤的最佳治療方式。由于血腦屏障的存在，化療藥物往往無法在腦內達到一定濃度并直接作用于神經膠質瘤。目前研究證實，新型烷化劑——替莫唑胺具有良好的抗膠質瘤作用[1]，臨床上廣泛用于成人頑固多形性成膠質細胞瘤、復發或進展的多形性膠質母細胞瘤或間變性星形細胞瘤的治療，但其在顱內的濃度僅為血液的40%。冰片具有“芳香走竄、引藥上行”的功效，能增加血腦屏障的通透性，促進其他物質在腦組織聚集，增加血藥濃度[2-3]。本研究在大鼠C6腦膠質瘤模型中聯合應用冰片和替莫唑胺，以期通過冰片開放血腦屏障，從而促進替莫唑胺通過血腦屏障，提高腦組織內藥物濃度，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物與細胞 健康雄性Wistar大鼠26只（清潔、無特定病原級），體重220～240g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；C6腦膠質瘤細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑與儀器 冰片（100g，批號110743，杭州胡慶余堂）；替莫唑胺（100mg，批號 H20130603，濟寧泰諾化工有限公司）；石蠟油500ml/瓶（南昌白云制藥公司）；0.9%氯化鈉溶液250ml/瓶（杭州民生制藥公司）；含10%FBS的 RPMI1640培養液（美國 Gibco公司）；TUNEL試劑盒（德國Roche公司）；3%戊巴比妥鈉、蘇木素染液、伊紅染液、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；10%多聚甲醛（浙江中醫藥大學動物實驗中心自行配制）；切片石蠟（上海國藥有限公司）。腦立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）；牙科鉆（淮北正華生物儀器設備有限公司）；輪轉式切片機（RM2235型，德國Leica公司）；病理組織漂烘儀（TEC2500型，常州市郝思琳儀器設備有限公司）。

1.3 細胞培養 取底面積75cm2的培養瓶數只，放入C6膠質瘤細胞，再加入適量RPMI 1640培養液，輕輕混勻后置于培養箱中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的環境下培養。當細胞生長至貼壁率＞80%時進行傳代。取對數生長期細胞，以適量0.25%胰蛋白酶處理3～5min，棄消化液。用平衡鹽溶液進行吹打，沖洗1～2次，形成細胞懸液。調整細胞濃度為1.5×105個/μl，并使用該濃度的細胞懸液進行接種。

1.4 模型制作 Wistar大鼠稱重后，以3%戊巴比妥鈉（1ml/100g）腹腔注射麻醉。取腦立體定向儀，固定大鼠頭部。在內眥連線與頭部正中矢狀面交點處作一標記，由此向后縱向切開頭皮約lcm，分離暴露顱骨。根據Batker法，以冠狀縫前lmm、中線右旁開3mm為右尾狀核點，使用牙科鉆在顱骨上鉆孔，直徑約1.2mm。使用微量注射器從培養基中抽取C6細胞懸液10μl，調節針尖，待觸及硬腦膜后沿鉆孔垂直進針5mm，后退1mm，將細胞懸液緩慢、勻速注入到尾狀核內，約10min。注射完畢后，留針5min退出，用明膠海綿填塞骨孔，外面骨蠟封閉。待大鼠蘇醒后，將其置于單籠環境飼養。造模第7天隨機選取6只大鼠斷頭取腦并分離腦組織，肉眼觀察腦組織表面未見明顯腫瘤組織；10%甲醛溶液固定，作石蠟切片，HE染色可見：腫瘤組織呈柵欄狀緊密排列，細胞核深染，與周圍的正常腦組織形成鮮明對比；正常腦組織與腫瘤組織之間可見一條較明顯的界線，存在腫瘤細胞浸潤及新生血管，見圖1（插頁）。提示建模成功。

1.5 分組與給藥 造模第14天按隨機數字表法將大鼠隨機分為4組，每組5只。（1）冰片聯合替莫唑胺組：每只大鼠按3ml/kg灌服10%冰片石蠟油溶液，1h后按1ml/100g腹腔注射替莫唑胺溶液（替莫唑胺25mg/kg溶于相應體積的0.5%羧甲基纖維素溶液中），1次/d，連續10d。（2）單用替莫唑胺組：每只大鼠按3ml/kg灌服0.9%氯化鈉溶液，1h后按上述方法腹腔注射替莫唑胺溶液，其余同上。（3）單用冰片組：每只大鼠按3ml/kg灌服10%冰片石蠟油溶液，1h后腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，其余同上。（4）空白對照組：每只大鼠按3ml/kg灌服0.9%氯化鈉溶液，1h后腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，其余同上。

1.6 一般情況觀察 每日觀察并記錄大鼠造模后精神、體重、飲食、活動量等一般情況，共觀察24d。

1.7 腫瘤最大橫截面積測量 末次給藥24h后處死大鼠，斷頭取腦，以10%甲醛溶液固定后，取出腦膠質瘤。以腫瘤中心為切入點作冠狀切面，測量每個切面腫瘤的最大橫截面積。

1.8 組織病理學觀察 取瘤組織制作石蠟切片、HE染色，觀察并比較各組大鼠腦膠質瘤組織病理學改變。

1.9 細胞凋亡率檢測 采用TUNEL法。石蠟切片，常規脫蠟，PBS沖洗；取50μl蛋白酶K消化，37℃下在濕盒中反應30min，PBS沖洗；吸干水份，每片加30μl TUNEL反應液，37℃在濕盒中反應60min，PBS沖洗；每片加30μl堿性磷酸酶抗體進行反應，37℃在濕盒中反應30min，PBS沖洗；吸干水份，每個載玻片上加一滴異硫氰酸熒光素，在室溫避光條件下孵育10min，PBS沖洗；予甘油和PBS封片，置熒光顯微鏡下進行觀察。然后用蘇木精重新染色，樹膠封片，置熒光顯微鏡下再次觀察。在40倍鏡下隨機選擇5個瘤區視野，計算瘤細胞總數，400倍鏡下計數陽性細胞（即凋亡細胞）。凋亡率=（凋亡細胞數/腫瘤細胞總數）×100%。

1.10 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后第2天基本恢復到術前水平，能自行進食、飲水。造模后至第18天大鼠活動較活躍，精神良好，能正常進食、飲水，體重一直增加，無明顯顱內高壓癥狀。第18～20天大鼠突然出現顱內高壓癥狀，表現為精神萎靡、反應遲鈍、毛色晦暗、食欲不振、體重開始下降、身體虛弱、活動明顯減少等癥狀，甚至出現偏癱、全身抽搐，但無死亡。第22天空白對照組死亡1只；第23～24天空白對照組、單用冰片組各死亡1只。

2.2 各組大鼠腦膠質瘤最大橫截面積比較 冰片聯合替莫唑胺組腦膠質瘤最大橫截面積小于單用冰片組、單用替莫唑胺組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。單用替莫唑胺組腦膠質瘤最大橫截面積小于單用冰片組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠腦膠質瘤最大橫截面積比較（n=5）

2.3 各組大鼠腦膠質瘤組織病理學觀察結果 解剖大鼠可見右尾狀核區有團塊狀腫瘤形成，呈圓形或橢圓形，向周圍腦組織浸潤性生長，瘤體較大時可見中線向對側移位。HE染色結果顯示：空白對照組、單用冰片組呈典型的腦膠質瘤細胞特征，細胞核呈高密度聚集，表示細胞增殖活躍；冰片聯合替莫唑胺組細胞核密度降低，表示細胞增殖受抑制；單用替莫唑胺組細胞核密度介于兩者之間，見圖2（插頁）。

圖1 造模第7天大鼠腦組織HE染色結果（×200）

圖2 各組大鼠腦膠質瘤組織切片HE染色結果比較（a：冰片聯合替莫唑胺組；b：單用替莫唑胺組；c：單用冰片組；d：空白對照組；×400；藍色表示細胞核）

圖3 各組大鼠腦膠質瘤組織切片TUNEL染色結果比較（a：冰片聯合替莫唑胺組；b：單用替莫唑胺組；c：單用冰片組；d：空白對照組；×400；藍色表示凋亡細胞）

2.4 各組大鼠腦膠質瘤細胞凋亡率比較 TUNEL染色結果顯示：空白對照組與單用冰片組相近，基本看不到凋亡細胞；單用替莫唑胺組可見少量凋亡細胞；冰片聯合替莫唑胺組凋亡細胞明顯增多，見圖3（插頁）。冰片聯合替莫唑胺組細胞凋亡率高于單用替莫唑胺組、單用冰片組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；單用替莫唑胺組細胞凋亡率高于單用冰片組、空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腦膠質瘤細胞凋亡率比較（n=5）

3 討論

神經膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，替莫唑胺是其主要化療藥物[4]，但血腦屏障的阻礙以及化療的不良反應均會降低化療效果[5]。目前主要采取手術切除+放化療治療，但患者術后中位生存期僅為12～18個月[6]。因此，尋找一種治療神經膠質瘤的更有效藥物迫在眉睫。

血腦屏障是血漿與腦細胞之間的天然屏障，可阻礙外來物質經血液進入腦組織，起到保護大腦的作用。但同時也會限制藥物的進入，使其在腦組織中難以達到有效濃度，不利于腦部疾病的治療。因此，改變血腦屏障通透性是當前研究的熱點。冰片味辛、苦，微寒，歸心、脾、肺經，具有抗炎鎮痛、促進藥物吸收、芳香走竄、引藥上行的功效。研究表明，冰片是一種小分子脂溶性單帖類物質，不僅自身能快速通過血腦屏障，還能增加血腦屏障通透性[7]。Wu等[8]一項動物實驗結果表明，冰片通過血腦屏障可能與細胞間黏附分子-1表達增加有關。研究表明，C6腦膠質瘤模型的移植瘤株繁殖力和生存力均較強，相對其他模型更易建立，與人腦膠質瘤的組織形態學、分子生物學及細胞生物學等特性相似，是目前研究腦腫瘤臨床療效的較好模型[9]。C6腦膠質瘤細胞接種到Wistar大鼠顱內后，腫瘤呈浸潤生長且生長較快，與正常腦組織的界線較不明顯，且有豐富的血管形成，與人腦膠質瘤的侵襲性生長相似；此外，Wistar大鼠較SD大鼠更適合腦膠質瘤相關研究[10]。

筆者所在團隊既往建立Wistar大鼠的C6腦膠質瘤模型進行試驗，結果發現冰片可通過提高血腦屏障通透性，從而增加對順鉑的攝入，使腦組織內順鉑濃度升高，進而提高對膠質細胞瘤的療效[11]。王南卜等[12]通過體外培養U251細胞并聯合冰片使用替莫唑胺，結果發現替莫唑胺抑制腫瘤細胞增殖的作用明顯增強，同時促進了腫瘤細胞的凋亡。Han等[13]聯合使用冰片與ANGPEG-PAMAM聚合物，結果發現冰片能增強血腦屏障的通透性，提高ANG-PEG-PAMAM聚合物體外抗神經膠質瘤的作用。亦有研究表明，冰片與Pep-1聯合使用能靶向IL-13受體過度表達的膠質瘤，并穿透腦微血管內皮細胞相關的生理障礙，增強藥物的穿透能力，與其他對照組比較，聯合冰片組的藥物在腦膠質瘤中具有更強的熒光信號和更長的保留時間[14]。

本研究通過建立Wistar大鼠的C6腦膠質瘤模型，并聯合應用冰片和替莫唑胺，結果發現冰片聯合替莫唑胺組腫瘤最大橫截面積明顯小于其余各組，腫瘤細胞密度降低，增殖被明顯抑制，腫瘤細胞凋亡率明顯高于其余各組；而單用替莫唑胺組可見少量凋亡細胞。因此，筆者認為替莫唑胺不能高效地透過血腦屏障，而聯合應用冰片對替莫唑胺抗大鼠膠質瘤具有促進作用。其作用機制可能與冰片開放血腦屏障、促進替莫唑胺通過、提高大鼠腦組織替莫唑胺濃度有關。但本研究局限于動物實驗，具體給藥方式和人體內藥動學等問題尚需進一步研究。