結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的臨床意義探討

袁航 屠世良

結(jié)直腸癌是常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一。近年來，總發(fā)病率呈明顯遞增趨勢。一項流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居所有腫瘤的第5位，5年生存率較低[1]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并給予個體化綜合治療具有重要意義[2]。microRNA（以下簡稱miRNA）是一類20～25個堿基的小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。目前發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。關(guān)于miRNA的作用機制研究成為當(dāng)前腫瘤發(fā)生機制研究的熱點。與其他基因一樣，腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達受到包括DNA甲基化修飾在內(nèi)的表觀修飾等多種機制的調(diào)控，且在多種腫瘤中miRNA基因甲基化狀態(tài)的改變與腫瘤臨床表型及預(yù)后有關(guān)。由于不同組織來源的腫瘤存在特征性的miRNA表達譜，其甲基化狀態(tài)也存在特異性[3]。目前關(guān)于結(jié)直腸癌中相關(guān)miRNA的CpG島甲基化狀態(tài)的研究仍較為少見。miR-34a是近年來發(fā)現(xiàn)的、具有抑癌基因樣功能的重要調(diào)控因子[4]。有研究對結(jié)直腸癌組織中表達有差異的miRNA基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a的啟動子區(qū)域或周圍有CpG島[5]。本研究對結(jié)直腸癌組織miR-34a啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的臨床意義作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年7月至2012年7月在本院行根治性切除術(shù)的48例結(jié)直腸癌患者為研究對象，收集其結(jié)直腸癌組織及癌旁5cm以上的正常黏膜組織。其中男28 例，女 20 例；年齡 29～75[62.5（54.3，72.0）]歲。所有患者術(shù)前未行放化療；其病理診斷經(jīng)2位病理科醫(yī)生獨立診斷明確，病理分期依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南公布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織離體后盡快分塊，每塊150～200mg，液氮冷凍后置-80℃冰箱內(nèi)備用。按照組織DNA抽提試劑盒說明書（北京天根生化公司）抽提結(jié)直腸組織基因組DNA，并測定濃度。

1.2.2 miR34-a啟動子區(qū)甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR（MSP）法。通過在線Meth-Primer軟件（http://www.urogene.org/methprimer/）設(shè)計甲基化、非甲基化序列的引物（其信息見表1[5]），以亞硫酸氫鈉修飾后的DNA為模板進行PCR擴增：95℃預(yù)變性10min，94℃15s，共40個循環(huán)；55℃ 30s，72℃ 40s，再 72℃延伸 10min。非甲基化擴增體系的退火溫度提高至56℃，其他步驟相同。擴增產(chǎn)物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射顯帶。RT-PCR：取1～2μl甲基化修飾型DNA進行PCR，擴增產(chǎn)物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后紫外光照射顯帶，確定與引物互補的DNA序列甲基化狀態(tài)。對PCR產(chǎn)物進行電泳，并根據(jù)電泳條帶情況進行判定：（1）甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異性引物未擴增出條帶，為甲基化；（2）非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而甲基化引物未擴增出條帶，為非甲基化；（2）對引物均能擴增出目的條帶的半甲基化，判斷為甲基化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank法比較不同miR-34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的結(jié)直腸癌患者總生存率、無病生存率。結(jié)直腸癌預(yù)后危險因素的分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 miR-34a甲基化引物信息

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區(qū)甲基化率比較 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區(qū)甲基化率分別為47.9%（23/48）、43.8%（21/48），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），檢測所得電泳圖見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測電泳圖（M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、遠處轉(zhuǎn)移等無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

2.3 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系 本組患者隨訪時間15～100[52（42，79）]個月。23例結(jié)直腸癌組織甲基化患者1、3、5年生存率分別為100.0%、69.6%和 34.8%，25例非甲基化患者 1、3、5年生存率分別為100.00%、88.0%和72.0%。甲基化患者總生存率、無病生存率均低于非甲基化患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 2-3。

2.4 結(jié)直腸癌預(yù)后危險因素分析 經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、miR-34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者預(yù)后有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；性別、年齡、腫瘤最大直徑、病理組織學(xué)類型、分化程度、浸潤深度與預(yù)后均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。將上述單因素分析結(jié)果P＜0.05的因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示遠處轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），miR-34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)不是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＞0.05），見表3。

表2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

表3 結(jié)直腸癌預(yù)后危險因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討論

miRNA主要通過促進靶mRNA的降解或抑制其翻譯過程來發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及分化等過程。Monzo等[6]首次研究表明，結(jié)直腸癌及腺瘤性息肉組織中miR-143、miR-145表達明顯下調(diào)，并提出結(jié)直腸癌組織中存在特異性miRNA表達譜。隨后，結(jié)直腸癌組織特異性miRNA表達譜的測定以及其與患者臨床特征的關(guān)系成為研究熱點。miR-34a位于人染色體1p36.23，該位點多伴隨著多個基因的缺失或突變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在乳腺癌、肺癌組織中，miR-34a表達常下降或缺失；但關(guān)于其在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，各研究結(jié)果尚不統(tǒng)一[4，7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在其啟動子區(qū)具有p53蛋白結(jié)合位點，是p53直接下游靶基因，受p53激活轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（cyclinE2、cdk6等）的表達，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，或通過抑制下游BCL-2靶基因來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10]。Hiroshi等[9]在大腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中，觀察到miR-34a有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

圖2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化與非甲基化患者總生存率的曲線

圖3 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動子區(qū)甲基化與非甲基化患者無病生存率的曲線

甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一。DNA甲基化在調(diào)控細(xì)胞正常發(fā)育、基因表達模式及基因組的穩(wěn)定性中起著重要作用。DNA甲基化主要發(fā)生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。這些常在基因上游調(diào)控區(qū)的啟動子區(qū)高度聚集的CpG二核苷酸，稱為CpG島。在人類許多腫瘤中，都能發(fā)現(xiàn)不同程度的CpG島異常甲基化現(xiàn)象，表現(xiàn)為基因組整體甲基化下調(diào)，抑癌基因調(diào)控區(qū)域甲基化上調(diào)[11]。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分患者結(jié)直腸癌組織miR-34a甲基化較高，但與癌旁正常組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中miR-34a基因CpG島甲基化狀態(tài)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與患者預(yù)后無關(guān)。甲基化狀態(tài)與預(yù)后呈相關(guān)性，提示甲基化狀態(tài)的改變可能參與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移過程，并影響預(yù)后。DNA甲基化修飾可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞中相關(guān)miRNA的表達。Satio等[12]較早發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能會影響miRNA的表達，同時指出DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控miR-127的表達，且甲基化與組蛋白修飾間存在一定的協(xié)同作用；miRNA不僅參與表觀遺傳的調(diào)控（DNA甲基化），還受到DNA甲基化等表觀遺傳影響。有研究報道m(xù)iR-34a在宮頸癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤組織中呈CpG島高甲基化狀態(tài)，且高甲基化所致的表達沉默或下調(diào)可能導(dǎo)致下游靶標(biāo)增殖或凋亡相關(guān)癌蛋白高表達，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5，13-16]。有研究在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了一些相關(guān)miRNA存在甲基化調(diào)節(jié)機制[17]。某研究表明，結(jié)直腸癌中miR-34a低表達者，其啟動子區(qū)甲基化水平較高，兩者呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究Cox比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，僅遠處轉(zhuǎn)移是預(yù)后的獨立預(yù)測因子，miR-34a啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)尚不能作為獨立預(yù)測因子；這可能與樣本量較小有關(guān)，也可能是miR-34a與下游靶分子形成交叉網(wǎng)絡(luò)作用，而非獨立作用。以上猜想仍需后續(xù)機制研究進一步驗證。

綜上所述，miR-34a啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后有關(guān)，可能參與腫瘤進展轉(zhuǎn)移過程的調(diào)控。