干細胞因子抑制糖氧剝奪誘導的人腦微血管內皮細胞內質網應激性凋亡的研究

陳思瑩 饒杰 盧曄芬 陳建軍 程偉進 鄭麗云

據統計，腦卒中年發病率高達1 287.3/10萬，死亡率為126.4/10萬，嚴重著威脅人們的健康[1]。在腦缺血、缺氧條件下，腦血管內皮細胞易發生損傷或壞死，再灌注損傷后往往導致腦缺血后二次損傷[2-3]。如何防治腦血管再灌注損傷是當前腦卒中的研究熱點和難點[4]。干細胞因子（stem cell factor，SCF）與其酪氨酸激酶受體（c-Kit）構成SCF/c-Kit通路，參與細胞活性功能調節，對缺血、缺氧組織具有保護作用[5]。然而，目前關于腦血管缺血再灌注損傷的保護作用及其分子機制尚未完全明確。本研究就SCF對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制作一探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）抑制劑Compound C（S7306）、激活劑阿卡地新（AICAR）（S1802）購自美國塞萊克公司，SCF（S7901-10UG，≥97.0%）、噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒及凋亡試劑盒購自中國上海碧云天生物技術有限公司；AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）、C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CHOP）、斷裂半胱氨酸蛋白酶-12（cleaved Caspase-12）、Bcl-2相關 X 蛋白（Bax）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購自美國細胞信號技術（CST）公司。人腦微血管內皮細胞（h-BMEC）購自美國Scien Cell研究實驗室。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將h-BMEC置于含10%FBS的杜爾伯科改良伊格爾培養基（DMEM，100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，在 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2～3d更換新鮮培養基，待細胞融合80%時進行傳代培養。

1.2.2 分組與建模 采用隨機數字表法，將h-BMEC分為對照組、糖氧剝奪（OGD）組、SCF+OGD組（簡稱SCF組）、SCF+Compound C+OGD組（簡稱Comp C組）和SCF+AICAR+OGD組（簡稱AICAR組）。依據文獻[6]的方法，建立細胞糖氧剝奪模型。待細胞融合達80%以上時，用PBS洗滌1次，加入無糖培養基，并將培養器皿置入OGD培養裝置中，向內沖入混合氣體（95%N2+5%CO2），持續6h；更換含20%FBS的高糖培養基。SCF組、Comp C 組、AICAR組分別予 300μmol/ml SCF、1μmol/L Compound C、1mmol/L AICAR處理OGD細胞；對照組在常規條件下置培養箱中培養。將各組置入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中繼續培養24h。

1.2.3 細胞存活率檢測 采用MTT法。調整h-BMEC密度為2×104個/ml，接種于96孔培養板，待細胞融合達80%左右時，按上述分組方法進行實驗，并設置調零孔，每組設置6個復孔。24h后，加入20μl MTT，37℃恒溫箱孵育1～2h，棄培養基，加入二甲亞砜；以調零孔光密度值調零校準，使用酶聯免疫檢測儀在492nm波長處檢測各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.4 細胞內SOD活性和MDA含量檢測 分別采用水溶性四唑鹽-8（WST-8）、硫代巴比妥酸（TBA）法進行檢測。調整h-BMEC密度為2×105個/ml，接種于6孔板中，按上述分組方法進行實驗。按照SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒說明書進行操作。上機檢測，使用酶標儀分析細胞內SOD活性和MDA含量。

1.2.5 細胞凋亡率檢測 采用膜聯蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）雙染法。0.25%胰酶消化并收集細胞，PBS洗滌細胞2次，使用500μl上樣緩沖液重懸，依次加入 5μl Annexin V、5μl PI，室溫下避光孵育 15min，上機檢測，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白表達檢測 采用Western blot法。調整h-BMEC密度為2×105個/ml，接種于6孔板中，按上述分組方法進行實驗。24h后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）細胞裂解液冰上裂解15min，12 000r/min離心15min，吸取上清液，收集總蛋白。采用二喹啉甲酸(（BCA）法定量后，取20μg總蛋白用6%～10%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，10%脫脂牛奶封閉10min。加入適當稀釋度的一抗（AMPK、p-AMPK、PERK、CHOP、Caspase-12、Bax、Bcl-2、β-actin），4℃孵育，過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗體，在室溫下孵育1～2h，PBST洗滌；經化學發光試劑發光、顯影和定影后，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，即相對表達量。

1.3 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組h-BMEC細胞存活率比較 OGD組、SCF組、Comp C組、AICAR組、對照組細胞存活率分別為（51.26±9.37）%、（88.23±6.68）%、（93.61±7.40）%、（55.11±8.65）%、（97.15±4.18）%。與對照組比較，OGD組、AICAR組細胞存活率均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組細胞存活率均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組細胞存活率降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而Comp C組細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組h-BMEC細胞內SOD活性和MDA含量比較 與對照組比較，OGD組、AICAR組SOD活性均降低，MDA含量均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；SCF組、Comp C組SOD活性均增高，MDA含量均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組SOD活性降低，MDA含量增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組h-BMEC細胞內SOD活性和MDA含量比較

2.3 各組h-BMEC細胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達比較 與對照組比較，OGD組、AICAR組Bcl-2表達均降低，細胞凋亡率、Bax表達、Bax/Bcl-2均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組Bcl-2表達均增高，細胞凋亡率、Bax表達、Bax/Bcl-2均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組Bcl-2表達降低，細胞凋亡率、Bax表達、Bax/Bcl-2均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2和圖1。

表2 h-BMEC細胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達比較

圖1 各組h-BMEC的Bax、Bcl-2表達的電泳圖

2.4 各組h-BMEC內質網應激性凋亡相關蛋白表達比較 與對照組比較，OGD組、AICAR組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3和圖2。

表3 各組h-BMEC內質網應激性凋亡相關蛋白表達比較

圖2 各組h-BMEC內質網應激性凋亡相關蛋白表達的電泳圖

2.5 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達比較 與對照組比較，OGD組、AICAR組p-AMPK表達均增高，SCF組、Comp C組均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組p-AMPK表達均降低，AICAR組增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組p-AMPK表達增高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4和圖3。

表4 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達比較

圖3 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達的電泳圖

3 討論

SCF與其c-Kit廣泛分布于中樞神經系統，參與腦組織的發育和功能調節。SCF/c-Kit通過對中樞神經系統具有重要的保護作用。Dhandapani等[7]發現SCF可抑制谷氨酸神經毒性反應。Sun等[8]證實SCF可促進腦損傷局域神經修復。羅云等[9]證實缺血性損傷可增加SCF表達，降低腦細胞損害，提示SCF/c-Kit通路與缺血性損傷修復密切相關。本研究結果發現，與OGD組比較，SCF組細胞存活率明顯增高，細胞凋亡率明顯下降，Bax表達降低，Bcl-2表達增高，Bax/Bcl-2下降，而SOD活性增高，MDA含量降低；這說明SCF具有抑制OGD誘導h-BMEC損傷作用。本研究還發現，OGD細胞內CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達明顯增高；這說明在OGD條件下，細胞啟動了內質網應激性凋亡。與OGD組比較，SCF 組 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12 表達明顯降低，這說明SCF具有抑制OGD誘導內質網應激性凋亡的作用。

內質網應激性凋亡是指在應激狀態持續或強化條件下，通過級聯活化凋亡信號通路，促使細胞凋亡，其中CHOP是最經典的凋亡通路。CHOP接受PERK、質網核信號轉導蛋白 a1（IRE1）、活化轉錄因子 6（ATF6）、活化轉錄因子4（ATF4）等分子激活后，轉而促進Caspase-12活化或Bcl-2降解，從而啟動細胞凋亡。有學者報道，內質網應激性凋亡途徑受AMPK通路調控[10-11]。Yang等[10]證實，鉬通過激活AMPK依賴的內質網應激誘導胰島β細胞功能紊亂和凋亡。本研究結果發現，OGD組細胞內p-AMPK表達明顯增高，而SCF組較OGD組明顯降低；這說明SCF對AMPK的活化具有明顯抑制作用。與SCF組比較，AICAR組細胞存活率差異無統計學意義，凋亡比例明顯增高，Bax表達增高，Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2增高，SOD活性降低，MDA含量增高，CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達明顯降低；Comp C組細胞存活率、細胞凋亡率以及 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達差異均無統計學意義。以上結果說明OGD細胞中AMPK被活化，且AMPK介導SCF抵抗OGD誘導內質網應激性細胞凋亡作用。

綜上所述，SCF對OGD誘導的h-BMEC損傷具有抑制作用，其分子機制與抑制AMPK介導的內質網應激性凋亡有關。