孕婦血清淀粉樣P物質作為神經管缺陷產前標志物的研究

董乃萱，顧卉，劉丹，魏曉偉，馬巍，馬玲，袁正偉

（中國醫科大學附屬盛京醫院衛生部小兒先天畸形重點實驗室，沈陽 110004）

神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是最常見和致殘率最高的出生缺陷之一［1］，通過在懷孕早期增加母親的葉酸攝入量可以降低NTDs的發生率，但仍不能完全預防所有NTDs的發生［2-3］。因此，早期發現和診斷NTDs至關重要。蛋白組學的發展有助于識別新的生物標志物，建立與NTDs相關的分子網絡［4］。

血清淀粉樣P物質（serum amyloid P component，SAP）是正五聚蛋白家族的一員，在肝細胞中產生并循環于血液中，可以結合所有類型的淀粉樣纖維［5］。SAP 在生理狀態下可以特異地、Ca2+依賴性地與DNA、染色質結合，參與因細胞死亡而暴露的染色質的清除［6］。研究發現，SAP有助于神經退行性相關疾病的診斷。通過測量腦脊液中SAP的含量可以幫助識別早期阿爾茲海默病和輕度認知障礙［7］，SAP有潛力成為診斷帕金森病的血清標志物［8］。在唐氏綜合征中，SAP表達顯著下調，有成為其新型生物標志物的可能［9］。

前期研究中，本研究組利用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術篩查正常孕婦和胎兒患有NTDs孕婦血清中的差異蛋白，發現SAP可能與NTDs相關。目前尚未有報道稱SAP同NTDs相關，因此，本研究將重點驗證SAP在正常孕婦血清和NTDs胎兒孕婦血清中的表達情況，探討其作為NTDs產前標志物的可能。

1 材料與方法

1.1 血清樣本收集

收集2010年1月至2011年12月在中國醫科大學附屬盛京醫院經產前超聲診斷且在胎兒引產后確診的NTDs共12例（病例組）。根據病例組采集的孕周、孕婦年齡和采集時間等條件匹配12例正常孕婦，作為對照組。分別于12、14、15、19、21、23、26、28、29、33、37、38孕周采集血清樣本。于清晨空腹抽取2組孕婦外周靜脈血5 mL，立即放入4 ℃靜置1～2 h，4 ℃離心10 min（1 600 r/min）。吸取上清后分裝置于-80 ℃保存備用。本研究經中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會批準同意，所有研究對象均知情同意。

1.2 方法

采用Western blotting 驗證差異蛋白的表達水平。取2組血清100倍稀釋后，12 μL/孔上樣行10%SDS-PAGE，電轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入鼠抗人SAP單克隆抗體（1︰1 000稀釋，中國Proteintech公司）和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（內參照），4 ℃反應過夜。次日，用TBST洗膜3次后，加入羊抗鼠IgG（1︰2 000 稀釋，中國中杉金橋公司），常溫下置于搖床反應2 h，二抗均帶有辣根過氧化物酶標記物。用TBST洗膜5次后，采用ImmobilonTMWestern（美國Millipore公司）進行底物的化學發光。經Image J軟件（美國National Institutes of Health公司）量化條帶，以目的蛋白條帶與內參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。2組間的比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。為判斷利用SAP早期診斷NTDs的價值，繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）。

2 結果

2.1 SAP在不同妊娠時期孕婦血清中的表達水平

SAP蛋白在不同妊娠時期孕婦血清中均有表達，主要以27×103條帶分布（圖1A）。SAP蛋白的表達水平存在一定的時間依賴性，在妊娠12周開始呈上調趨勢，在妊娠21～28周達到峰值，并在妊娠28周以后趨于穩定（圖1B）。在妊娠12～19周、21～28周時，SAP在病例組孕婦血清中的表達明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。妊娠12～19周、21～28周時，病例組較對照組分別下調48%～50%、79%～80%（圖1B）。

圖1 不同妊娠時期SAP蛋白在2組孕婦血清中的表達Fig.1 Expression of SAP protein in the serum of normal group and case group during different gestational weeks

2.2 ROC曲線分析

如圖2所示，AUC=0.770 8（95%CI：0.573 9～0.967 8），P=0.024。根據ROC曲線計算，Youden’s指數最大值時，診斷效能客觀上達到最佳的診斷分界點，此時敏感度為83.33%，特異度為66.67%。

圖2 ROC曲線Fig.2 Receiver operating characteristic curve

3 討論

目前，NTDs的診斷很大程度上依賴于超聲顯像對胎兒的結構評估，生化特征（如母體血清中甲胎蛋白的含量）則被用作次級篩查工具［10-12］。研究［13］顯示，常規超聲檢查診斷NTDs的敏感度和特異度分別為75.5%和34.9%。但超聲診斷胎兒腰骶部微小病變的敏感度較差，且超聲診斷主要依賴于超聲檢查者的經驗和手法的嫻熟程度。甲胎蛋白測定的陽性診斷率高，但特異度低，易受到其他因素的影響，如先天性腹裂、死胎等［14-15］。母體血清學檢查是一種安全、無創的產前檢查，如果能找到更具敏感度和特異度的血清標志物，則更利于早期診斷NTDs。本研究中，ROC結果顯示，SAP診斷胎兒NTDs的敏感度為83.33%，特異度為66.67%。

SAP為血清正常糖蛋白，被認為可以調控染色質的降解，在早期階段同凋亡細胞結合，參與體內細胞凋亡的進程［16］。有序的細胞死亡調節了胚胎發育的正常過程，如神經管背腹構型［17］。但這種受基因調控的細胞死亡極易受到各種因素的干擾，引起發育異常，從而導致畸形的發生。研究［18-19］顯示，過度的神經上皮細胞凋亡與NTDs的發病密切相關。因此，推測SAP在NTDs的母體血清中表達下調可能源于細胞的過度凋亡。組蛋白H1/H5和H4與SAP的123～132殘基具有高度同源性，SAP在細胞凋亡和壞死后可與核抗原結合，清除致病性細胞碎片［20］。當NTDs發生時，細胞凋亡增加，導致細胞碎片增多，大量的SAP與這些細胞碎片結合，從而導致血清中SAP的含量降低。

SAP作為正五聚體蛋白家族的一員，還參與創傷修復和先天性免疫應答，是體內的急性時相蛋白［21］。在慢性神經退行性疾病中，補體激活少突神經膠質，受損腦組織的SAP表達水平與包覆少突神經膠質的補體C4d和C3d的表達水平相平行，推測SAP參與補體的激活途徑［22-23］。研究［24］發現，在室間隔缺損患者的血清中，SAP水平也顯著降低，SAP與室間隔缺損患者的先天免疫功能下降相關，SAP表達下調提示患者對感染和肺部疾病更加易感。在胚胎的正常發育過程中，固有免疫起很重要的作用，推測SAP、固有免疫系統與NTDs三者密切相關。SAP的血清濃度異常，可以提示胎兒有NTDs的風險，SAP有作為無創產前診斷的血清生物標志物的可能。

在妊娠相關的疾病中，已有SAP作為唐氏綜合征篩查的候選血清標志物的報道［25］，但目前尚沒有SAP在NTDs診斷中應用的報道。本研究發現在胎兒NTDs的孕婦血清中SAP表達顯著降低，AUC達0.770 8，提示SAP有作為NTDs產前診斷標志物的潛在可能。