HPLC法測定截短側耳素發酵液含量方法探討

庫麗扎達·木拉提

（新疆維吾爾自治區獸藥飼料監察所，烏魯木齊 830063）

獸藥在保證動物源性食品供應方面發揮著巨大作用。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥性問題變得日益嚴重，多藥耐藥菌感染已成為威脅人類健康的重要問題，截短側耳素類是具有較好抗菌活性的抗生素家族，對大部分革蘭氏陽性菌以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑菌效果。截短側耳素發酵液具有毒性較低，對環境影響小等特點。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent1260(美國Agilent公司)；十萬分之一天平（Mettler xs105）；5 mL一次性注射器。

1.2 試劑和試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司），乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司），水（超純水），高氯酸（分析純，北京北化精細化學品有限公司），碳酸銨（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；截短側耳素標準品(批號為20170314，含量為99.7%,中國獸醫藥品監察所)，截短側耳素發酵液（發酵放罐樣品）。

1.3 溶液的制備

1.3.1 高氯酸溶液（6%）

量取400 mL超純水置于500 mL容量瓶中，再用刻度吸管移取41.7 mL高氯酸（分析純）置于該容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。

1.3.2 碳酸銨緩沖溶液（1%）

精確稱量10 g碳酸銨（分析純）置于1 000 mL容量瓶中，加入800 mL超純水溶解，用刻度吸管移取6%高氯酸溶液24 mL加入其中，再用超純水稀釋至刻度混勻，過濾，待用。

1.3.3 流動相溶液

按照碳酸銨緩沖溶液（1%）：色譜級乙腈：色譜級甲醇28：23：49的比例混合均勻，再用0.45 μm的過濾膜過濾，濾液置于所配體積的容量瓶中，超聲15 min脫氣，備用。

1.4 標準品溶液

精確稱量截短側耳素工作標準品適量（約0.1 g）（精確至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，用流動相溶解，超聲15 min，使之充分溶解，冷卻，定容，配成濃度為2 mg/mL的溶液，待用。

1.5 樣品溶液的制備

根據發酵周期，預估含量稱重，放入50 mL容量瓶中，加入流動相30 mL左右溶解，振蕩超聲15 min，冷卻至室溫，用流動相定容至50 mL，用微孔濾膜過濾器過濾。

式中：m1—標準品重量（g）； a—標準品含量（μg）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm,流動相為碳酸銨緩沖溶液（1%）：色譜級乙腈：色譜級甲醇 28：23：49的比例混合均勻，再用0.45 μm的過濾膜過濾，濾液置于所配體積的容量瓶中，超聲15 min脫氣，備用，流速為1.2 mL/min，檢測波長為212 nm，柱溫為30±3℃，進樣量20 μL。

2.2 檢測方法

首先進標準品溶液兩針（1.4），記錄相關峰面積，再進樣品溶液兩針（1.5），記錄相關峰面積，計算截短側耳素發酵液含量（發酵350 h以上的效價，應≥10 000 μg/g）。計算公式為

式中：S1—待測溶液色譜圖峰面積；S0—標準品溶液色譜圖峰面積；m0—標準品重量 （g）；m1—待測溶液重量（g）；A—標準品的含量（%）。 (結果見圖1、圖 2)

圖1 截短側耳素標準品色譜圖

圖2 截短側耳素發酵液樣品色譜圖

2.3 檢測結果

含量測定結果，見表1。

表1 含量測定結果表

2.4 精密度試驗

取1.5項下截短側耳素樣品20 μL，按2.1項下色譜條件重復進6次，記錄色譜圖峰面積，結果見表2，截短側耳素峰面積的RSD為0.13%，表明色譜系統精密度良好。

表2 精密度試驗表

2.5 重復性試驗

取按1.5項制備的6份供試品，按2.1色譜條件分析，記錄色譜圖，計算含量，平均值為17 973.7 μg/mL，RSD為0.1%，表明該方法中截短側耳素的重復性良好，結果見表3。

表3 重復性試驗表

3 討論

用該方法測定截短側耳素發酵液含量，同一樣品平行測定6次，平均含量值為17976.6 μg/g，峰面積的RSD為0.13%；經測定6個樣品含量平均值為17 973.7 μg/g；RSD為0.10%；截短側耳素發酵液經過精密度試驗、重復性試驗測定結果RSD均在規定的范圍內，靈敏度高，前處理簡便，樣品較穩定，符合規定。

用HPLC法測定截短側耳素發酵液含量，適用范圍廣，方法合理、操作便捷，大大縮短檢驗時間。適合于截短側耳素發酵液的檢測，并控制該產品的質量，可作為截短側耳素發酵液的質量標準，用于截短側耳素的含量測定，以控制、保證產品質量。