基于芴母核的新型水溶性弱酸性熒光pH指示劑

李華錕，廖永芳，劉陽平

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，天津300070）

細(xì)胞內(nèi)pH的動態(tài)變化被認(rèn)為是理解細(xì)胞中許多生理功能調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)鍵[1]。pH值的有效控制對維持細(xì)胞正常的生理活動十分重要。目前細(xì)胞內(nèi)pH值測定方法主要有光化學(xué)法、弱酸弱堿分布法、微電極法、核磁共振法等幾種。其中光學(xué)方法有響應(yīng)時間快，高信噪比，無創(chuàng)性和良好的pH敏感性等幾個優(yōu)點(diǎn)。自從首次捕獲到細(xì)胞內(nèi)的pH探測器6-羧基熒光素后，Thomas等[2-3]已經(jīng)描述了很多pH指標(biāo)性質(zhì)[1,4-11]。

為了定量的測量pH值，需要指示劑的pKa與實(shí)驗系統(tǒng)的pH值相匹配。溶酶體與內(nèi)涵體是存在于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞的活動中扮演著重要的作用，所以對于這些細(xì)胞器的定位與追蹤，具有重要的意義。由于溶酶體和內(nèi)涵體的pH值分別在4～5和5～6之間，因此開發(fā)高效的弱酸性pH熒光指示劑是非常有意義的。在此，筆者報告一種基于新型芴衍生物的敏感的弱酸性熒光pH指示劑。

芴衍生物以其高熒光量子產(chǎn)率和優(yōu)異的光穩(wěn)定性著稱[12-13]。最近芴基共軛化合物因為其中具有高雙光子吸收（2PA）橫截面，也被報道為優(yōu)異的雙光子熒光（2PF）材料[14-18]。因此本文基于芴母核進(jìn)行衍生化以期得到可以指示弱酸性pH的熒光探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 二乙二醇-2-溴乙基甲醚、2,7-二溴芴、正丁基鋰（n-BuLi）、碘化鉀（KI）、二乙胺和2-氨基苯硫酚等試劑購買于阿拉丁試劑公司。干燥的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）購買于Sigma試劑公司。干燥的THF經(jīng)過金屬鈉干燥處理制備。核磁數(shù)據(jù)采集于Bruker 400M核磁共振波譜儀上。

1.2 目標(biāo)化合物的合成路線及合成步驟 見圖1。

1.2.1 化合物9,9-二乙二醇甲醚乙基-2,7-二溴芴2的合成 將2,7-二溴芴（0.907 g,2.8 mmol）、二乙二醇-2-溴乙基甲醚（1.294 g,5.7 mmol）溶于DMSO（7 mL） 中，當(dāng)然后加入 KI（0.049 g，0.3 mmol）和KOH（0.665 g，11.9 mmol），在氬氣保護(hù)下室溫攪拌1 h。將反應(yīng)液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），有機(jī)相水洗，無水 Na2SO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經(jīng)硅膠柱層析純化（PE:EA=10:1）得黃色化合物 2（1.328 g），產(chǎn)率 77%。

圖1 目標(biāo)化合物5的合成路線Fig 1 The synthetic route of target compound 5

1.2.2 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-溴芴-2-甲醛3的合成 將原料2，7-二溴芴（1.18 g，1.914 mmol）溶于干燥的 THF（7 mL）中，冷卻至-78 ℃，然后緩慢滴加n-BuLi（1.6 mol/L正己烷溶液，1.28 mL）。滴加完畢后 20 min，加入 DMF（0.21 mL，2.693 mmol）與 THF(0.37 mL)的混合溶液，反應(yīng)液在此溫度下反應(yīng)1.5 h，然后緩慢升至室溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)液冷卻至5℃，加入鹽酸水溶液（2 mol/L，1.5 mL）淬滅反應(yīng)。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取3次（40 mL×3），合并有機(jī)相并用飽和NaHCO3洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)硅膠柱層析純化（PE:EA=8:1）得白色目標(biāo)化合物（0.806 g），產(chǎn)率78.4%。

1.2.3 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基芴-2-甲醛4的合成 將化合物3（0.679 g，1.2 mmol）溶于干燥的DMF（4 mL），然后加入二乙胺（0.877 g，12 mmol），氬氣保護(hù)油浴加熱回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），1N 鹽酸水溶液洗滌（20 mL），水洗（20 mL），無水NaSO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物4（0.468 g），產(chǎn)率70%。

1.2.4 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基-2-（2-苯并噻唑）芴的合成 將化合物4（0.329，0.59 mmol）和 2-氨基苯硫酚（0.18 g，1.48 mmol）溶于DMSO（3 mL），油浴加熱195℃反應(yīng) 2.5 h。反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)液倒入水（30 mL）中，乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），飽和 NaHCO3洗滌，水洗，無水 Na2SO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經(jīng)硅膠柱層析純化（PE:EA=5:1）的黃色目標(biāo)化合物（0.265 g），產(chǎn)率68%。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物和中間體核磁數(shù)據(jù)的表征 在堿性條件下對2,7-二溴芴的9位進(jìn)行雙烷基取代得到化合物2，然后n-Buli拔溴與DMF反應(yīng)得到化合物3，隨后再與二乙胺發(fā)生親核取代發(fā)應(yīng)得到化合物4，化合物4與2-氨基苯硫酚縮合得到目標(biāo)化合物5。并對各中間體和目標(biāo)化合物進(jìn)行核磁表征，數(shù)據(jù)如下：

化合物 2：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.53-7.45（m，6H），3.54-3.52 （m，4H），3.50-3.47（m，4H），3.40-3.38（m.4H），3.34（s，6H），3.22-3.19（m，4H），2.77（t，J=7.6 Hz，4H），2.33（m，7.6 Hz，4H）（圖 2）。

化合物 3：1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ10.05（s,1 H）,7.92（s,1H)，7.88（dd，J=7.6，1.2 Hz，1H），7.79（d，J=8.0 Hz,1H），7.62（d，J=8.4 Hz，1H），7.63（d，J=2.4 Hz，1H），7.51（dd，J=8.0，1.6 Hz，1H），3.51-3.44（m，8H），3.36-3.33（m，10H），3.18-3.16（m，4H），2.79-2.75（m，4H），2.47-2.34（m，4H）（圖 3）。

圖2 化合物2核磁表征Fig 2 MNR Characterization of Compound 2

圖3 化合物3核磁表征Fig 3 MNR Characterization of Compound 3

化合物 4：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ9.96（s，1 H），7.83 （s，1H），7.78 （d，J=7.2 Hz，1H），7.60-7.51（m，2H），7.68-6.57（m，2H），3.51-3.18（m.26H），2.84-2.72（m，4H），2.45-2.26（m，4H），1.21（t，J=7.2 Hz，6H）（圖 4）。

化合物 5：1H NMR （400 MHz，MeOD）δ8.15（s，1H），8.01-7.98（m，3H），7.65-7.39（m，4H），6.80（s，1H），6.75（d，J=6.4 Hz，1H），3.49-3.18（m，26H），2.93-2.80（m，4H），2.51-2.34（m，4H），1.28-1.21（m，6H）（圖 5）。

圖4 化合物4核磁表征Fig 4 MNR Characterization of Compound 4

圖5 化合物5核磁表征Fig 5 MNR Characterization of Compound 5

2.2 化合物5紫外吸收變化與pH值的關(guān)系 質(zhì)子化的化合物5的最大吸收峰在341 nm，中性態(tài)化合物5的最大吸收峰在409 nm。紫外吸收光譜隨pH值的變化如圖6所示，隨著pH值的增加，化合物在341 nm的吸收強(qiáng)度逐漸降低，而409 nm的吸收強(qiáng)度逐漸升高，并在355 nm處形成一個等當(dāng)點(diǎn)。由于與芴相連的二乙胺基氮的堿性明顯高于苯并噻唑氮的堿性，因此質(zhì)子化優(yōu)先發(fā)生在二乙胺基氮的位置。根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，對341 nm處的紫外吸光度進(jìn)行非線性回歸，結(jié)果顯示化合物5的pKa為5.75±0.12。

圖6 在磷酸緩沖液中（50 mmol/L），化合物5（25 μmol/L）的吸收光譜顯示為pH依賴性，箭頭顯示吸收強(qiáng)度隨pH增加而變化。（箭頭）341 nm處吸光系數(shù)與pH值非線性擬合Fig 6 pH dependence of the absorption spectra of compound 5(25 μmol/L)inPB buffer(50 mmol/L)with arrow indicating thechange of the absorption intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinearfittingof the pH-dependent extinctioncoefficientsat341nm

圖7 在355 nm（吸收等當(dāng)點(diǎn)波長）處激發(fā)，化合物5（10 μmol/L）在磷酸緩沖液(50 mmol/L)中熒光強(qiáng)度顯示pH依賴性，箭頭顯示熒光強(qiáng)度隨pH增加而變化。（箭頭）391nm處熒光強(qiáng)度與pH值的非線性擬合Fig 7 pH-dependence of the fluorescence intensity of compound 5(10 μmol/L)in PB buffer(50 mmol/L)excited at 355 nm(absorption isobestic point wavelength in Fig 1)with arrow indicating the change of the fluorescent intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinear fitting of the pH-dependent fluorescent intensity at 391 nm

2.3 目標(biāo)化合物熒光強(qiáng)度變化與pH值的關(guān)系 由圖7所示，當(dāng)化合物5在等當(dāng)點(diǎn)（355nm）波長處被激發(fā)時，可以觀察到質(zhì)子態(tài)和中性態(tài)的熒光發(fā)射，分別在392 nm和571 nm。隨著pH值的增加，392 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，571 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加。根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，對392 nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行非線性回歸，結(jié)果顯示化合物5的pKa為5.88±0.06。這一結(jié)果與利用341 nm處的紫外吸光度進(jìn)行非線性回歸所得pKa相吻合。

3 討論

綜上所述，筆者通過4步反應(yīng)合成了目標(biāo)化合物5，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了核磁表征。紫外吸光光度法和熒光光譜法顯示，化合物紫外吸光系數(shù)與熒光強(qiáng)度隨著pH的變化而變化，通過非線性擬合顯示化合物的pKa為5.88，是一個弱酸性的pH熒光指示劑，筆者下一步的工作將要探索其在弱酸性環(huán)境的溶酶體和內(nèi)涵體方面的應(yīng)用前景。